唐文力，李宜航

(常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000)

催產(chǎn)素，又名縮宮素，是一種含有二硫鍵的環(huán)狀九肽激素，在人類和哺乳動物的垂體后葉中釋放，間接刺激子宮平滑肌收縮，模擬正常分娩的子宮收縮作用，導(dǎo)致子宮頸擴(kuò)張，從而達(dá)到促進(jìn)生產(chǎn)的功能，此外，催產(chǎn)素還可以刺激乳腺的平滑肌收縮，有助于乳汁自乳房排出，加快乳汁的分泌。所以催產(chǎn)素具有較高的藥用價值和應(yīng)用市場。

圖1 催產(chǎn)素合成路線

目前催產(chǎn)素的制備方法主要是以哌啶為脫帽試劑的多肽固相合成法[1-2]，主要存在制備方法成本相對較高，并且不方便運(yùn)輸和儲存的缺點。本研究采用以哌嗪作為脫帽試劑用Rink樹脂合成片段，哌嗪不是易制毒試劑，成本比經(jīng)典合成法用的易制毒試劑哌啶要低，并且更方便運(yùn)輸和儲存，此外，Rink樹脂合成片段還以方便自動化生產(chǎn)[3-8]；Rink樹脂可以回收重復(fù)利用；適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，沒有劇烈的化學(xué)反應(yīng)；降低了生產(chǎn)成本。合成工藝流程如圖1所示。

1 儀器與試劑

Agilent technologies 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli--Q超純水系統(tǒng)，德國默克密理博公司；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；GL-150干式恒溫器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；XW-80A旋渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司。

Rink Amide-AM Resin(Rink樹脂，替代度為0.48 mmol·g-1)，天津南開合成科技有限公司；所有氨基酸均采購自吉爾生化(上海)有限公司；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、二異丙基乙胺(DIEA)，均采購自蘇州昊帆生物股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)、二乙胺、石油醚均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑配制

2.1.1 Kaiser試劑

a液①40 g苯酚溶于10 mL無水乙醇；②65 mgKCN 溶于100 mL水，取2 mL用吡啶(pyridine)稀釋至100 mL。以10:100的比例混合①、②。

b液取2.5 g茚三酮溶于50 mL無水乙醇(需暗處保存)。

2.1.2 Fmoc-Ala-OH標(biāo)準(zhǔn)溶液

用電子天平精確稱取Fmoc-Ala-OH 標(biāo)準(zhǔn)品15 mg放入15 mL的離心管中。用移液槍精確移取10 mL 5%的哌嗪溶液，并將其加入裝有15 mg Fmoc-Ala-OH標(biāo)準(zhǔn)品的15 mL離心管中進(jìn)行溶解，大約搖晃十 min后，配置成Fmoc-Ala-OH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 脫保護(hù)溶液(5%哌嗪--DMF溶液)

5%哌嗪--DMF溶液：取25 g無水哌嗪溶于500 mL DMF中，配制成該溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表1 不同濃度的Fmoc-Ala-OH溶液

取7支10 mL的離心管，并對其依次編號為1、2、3、4、5、6、7，取適量配置好的Fmoc-Ala-OH標(biāo)準(zhǔn)溶液與不同量的DMF溶液配置成濃度依次為0 μmol/L、0 μmol/L、19.28 μmol/L、38.56 μmol/L、57.84 μmol/L、77.12 μmol/L、96.40 μmol/L的混合溶液，放置待用，見表1。

用分光光度計測得各濃度混合液的吸光度，見圖2。

圖2 Fmoc-ALa-OH 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 Gly-Rink 樹脂的制備

稱取1 g Rink Resin 于10 mL玻璃反應(yīng)器中；加入約8 mL 20%哌嗪-DMF脫保護(hù)約20 min；抽去反應(yīng)液，并用DMF洗滌2次、IPA洗滌3次、DMF洗滌4次。洗滌完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍(lán)黑色。

取10 mL塑料管稱取Fmoc-Gly-OH 約148 mg(依據(jù)為：樹脂質(zhì)量*取代率*氨基酸分子量*倍數(shù))，HBTU約189 mg，并用2 mL DMF溶解，接著加入DIEA約132 μL，將溶解后的溶液倒入玻璃反應(yīng)器中，渦旋5 min左右。將渦旋好的反應(yīng)器放置于搖床上搖置2 h，中途每0.5 h旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器一次。低壓抽去反應(yīng)液，并用DMF洗滌2次，IPA洗滌3次，DMF洗滌4次，取少許樹脂滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈淺黃色。

量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應(yīng)器中，反應(yīng)20 min，然后抽去反應(yīng)液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍(lán)黑色。

2.4 氨基酸與樹脂結(jié)合率的測定

從“2.3 Rink 樹脂和氨基酸相連”步驟中得到的“離心管(已標(biāo)記)” 中，依次取出15 μL，10 μL溶液于10 mL離心管中，并用DMF溶液在離心管中定容到9 mL，然后用分光光度計依次測定所取溶液的吸光度，測得結(jié)果見表2。

表2 待測物吸光度

根據(jù)丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液C-Abs曲線，將A209nm (y)=帶入0.56=0.0066x-0.0019，可以計算氨基的濃度(x)為85.13 μmol/L。進(jìn)一步可算出取代率為0.39 mol/g。

2.5 Fmoc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-樹脂的合成

得到Gly-樹脂后，向反應(yīng)體系中添加第二氨基酸保護(hù)單體Fmoc-Leu-OH 339 mg、縮合劑HBTU 364 mg和堿DIEA264 μL，溶劑為DMF，反應(yīng)時間為2 h，反應(yīng)完成后，用DMF洗滌4遍，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈無色，既反應(yīng)完全。得到Fmoc-Leu-Gly-樹脂后，量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應(yīng)器中，反應(yīng)20 min，抽去反應(yīng)液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗溶液呈藍(lán)黑色，既獲得Leu-Gly-樹脂。在獲得Leu-Gly-樹脂后，按照上述縮合反應(yīng)方法，依次Leu-Gly-樹脂上連接氨基酸保護(hù)單體：Fmoc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH后得到：Fmoc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-樹脂。

2.6 二硫鍵的形成

取300 mg粗產(chǎn)物，加入560 mg碘單質(zhì)和1.5 mL DMF溶液，混勻加入反應(yīng)瓶中。依次反應(yīng)2 h，4 h，6 h成環(huán)。其中

碘單質(zhì)的量=取代率/[(目的產(chǎn)物肽鏈分子質(zhì)量×取代率) +樹脂質(zhì)量]

2.7 環(huán)肽的裂解

按照特定的氨基酸順序合成完所需多肽后，就要把目標(biāo)多肽從樹脂上裂解下來，并進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

取環(huán)化后的粗品于反應(yīng)器中，分三次加入約2 mL三氟乙酸/三異丙基硅烷/水(TFA/TIS/H2O)=95/2.5/2.5(v/v)溶液，每次間隔20 min，收集濾液。向裝有濾液的離心管中倒入約40 mL冷凍的無水乙醚，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，震蕩并在6000 r/min，20 ℃條件下離心5 min，倒去溶劑乙醚，絮狀物用氬氣吹干沉淀。沉淀真空干燥24小時，固體殘留物用離子水溶解，冷凍干燥得到白色絮狀固體672 mg，-20 ℃保存。經(jīng)計算，產(chǎn)率為89.99%。

2.8 丙氨瑞林粗品的分析

對催產(chǎn)素進(jìn)行HPLC分析，色譜柱為Krosmail100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A相(0.1 M NaH2PO4/H2O)，洗脫液B(MeCN-H2O=1:1)；梯度洗脫：0～30 min；70%B～40%A，流速為1.0 mL/min，檢測波長為215 nm，其純度為97.68%，見圖3。

圖3 催產(chǎn)素色譜圖

2.9 樹脂回收

將樹脂用DMF洗滌三次，甲醇洗滌三次，抽去濾液，真空干燥。另配置二氯亞砜的DCM溶液，加入裝有樹脂的固相合成反應(yīng)器中，反應(yīng)2 h后，抽去反應(yīng)液，DCM洗滌。

3 結(jié) 論

催產(chǎn)素作為臨床使用藥物，現(xiàn)階段對其藥理活性研究較多，其合成研究相對較少。目前，在現(xiàn)有技術(shù)中，多采用液相合成方式，操作繁瑣且副產(chǎn)物較多，此外，現(xiàn)有技術(shù)多采用哌啶作為脫帽試劑，該試劑為易制毒管制試劑，采購及運(yùn)輸較為困難。本研究采用固相合成方式，反應(yīng)簡單，純度為97.68%，收率為89.99%，降低了生產(chǎn)成本，減少了副產(chǎn)物的生產(chǎn)。

本研究利用多肽固相合成法成功合成了催產(chǎn)素，該方法操作簡單，Rink樹脂合成片段可以方便自動化生產(chǎn)且成本較低，純度高，反應(yīng)條件溫和，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。