羅 強(qiáng)，張 明，劉 巧，羅 璠

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）是革蘭氏陽性球菌，屬腸球菌屬，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵香腸等發(fā)酵食品中[1-2]，被認(rèn)為能夠賦予發(fā)酵食品特殊風(fēng)味。由于其抗逆性強(qiáng)的特點，近年來常被作為益生菌用于飼料工業(yè)中。但屎腸球菌在臨床上又是一種條件致病菌，所代謝的有毒物質(zhì)、存在的多重耐藥性以及所攜帶的毒力因子可引起呼吸道、泌尿生殖道等多部位感染以及機(jī)體受損[3-4]，在公共衛(wèi)生方面存在較大的安全隱患。因此，屎腸球菌作為益生菌的應(yīng)用存在較大爭議，2004年加拿大禁止了屎腸球菌作為益生菌使用，但美國和我國允許其作為飼用添加劑在飼料中使用，以達(dá)到促進(jìn)動物生長、預(yù)防疾病等目的。由于屎腸球菌在使用上的爭議性以及菌株性質(zhì)的不明確性，在使用之前對其進(jìn)行菌株性質(zhì)評價與研究顯得尤為重要。

屎腸球菌SC-Y112是一株分離自四川紅原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌。前期研究表明，該菌株具有生長速度快、遺傳代謝性質(zhì)穩(wěn)定的特點，同時其產(chǎn)生的細(xì)菌素具有廣譜抗菌性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌等常見病原菌具有優(yōu)良的抑菌能力[5]，具備進(jìn)一步研究與開發(fā)的價值和潛力。本研究通過模擬腸胃液環(huán)境耐受實驗、膽鹽耐受實驗、抗氧化活性測定、溶血活性測定、明膠液化實驗、有害代謝物質(zhì)檢測、耐藥性評價及腸球菌毒力基因檢測對屎腸球菌SC-Y112的益生性質(zhì)與安全性質(zhì)進(jìn)行分析評價，以期探明菌株性質(zhì)，為食品及飼用添加劑菌株的開發(fā)與研究提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

屎腸球菌Enterococcus faeciumSC-Y112分離自四川紅原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳；屎腸球菌Enterococcus faecium467分離自傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜；強(qiáng)溶血性金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusF19分離自發(fā)酵香腸；質(zhì)控菌株大腸桿菌Escherichia coli8099、釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenesATCC 25923購于成都鵬世達(dá)實驗用品有限公司，并由青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室保藏。

DNA Marker II、DP302型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMasterMix聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混酶 天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白酶（酶活力＞250 U/mg） 丹麥BioFroxx公司；胃蛋白酶（酶活力1∶10 000） 美國Sigma公司；牛膽鹽 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；直接藍(lán)71、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 福州飛凈生物科技有限公司；溴甲酚紫、VC 上海源葉生物科技有限公司；A015-1-2型總抗氧化能力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。腸球菌屬毒力基因PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

吲哚試劑：稱取0.1 g的對二甲氨苯甲醛，用5 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液溶解，然后再緩慢加入2 mL濃鹽酸。現(xiàn)用現(xiàn)配，并避光保存。

生物胺檢測培養(yǎng)基[6]：蛋白胨5 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、氯化鈉2.5 g、葡萄糖0.5 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、硫酸鐵0.04 g、檸檬酸銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、碳酸鈣0.1 g、VB10.01 g、吡哆醛-5-磷酸0.05 g、溴甲酚紫0.06 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至5.3～5.5，115 ℃滅菌30 min，分別在生物胺檢測培養(yǎng)基中加入10 g/L的對應(yīng)前體氨基酸（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸）制成改良氨基脫羧酶檢測培養(yǎng)基。

明膠培養(yǎng)基：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明膠120 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)至pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；R40-IIB2超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；精密型pH計上海精密科學(xué)儀器有限公司；2500凝膠成像系統(tǒng) 中國天能公司；高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技有限公司；PCR儀、164-5050基礎(chǔ)電源電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

取保藏菌液以2%（以培養(yǎng)基體積計，后同）接種量接入5 mL滅菌MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置活化10 h備用。

1.3.2 模擬胃腸液耐受實驗

參照《中國藥典》[7]中提及的方法配制pH 2.0的模擬胃液和pH 6.8的模擬腸液。模擬胃液：取1 mol/L稀鹽酸溶液16.4 mL于容器中，加蒸餾水800 mL，加入10 g胃蛋白酶，混勻后轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至1 000 mL，過0.22 μm濾膜除菌備用，pH值約為2.0。模擬腸液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL蒸餾水溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加適量蒸餾水溶解，將兩溶液混合后轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至1 000 mL，過0.22 μm濾膜除菌備用。

取10 mL活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，6 000 r/min離心10 min后棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌兩次，在菌體中加入10 mL模擬胃液（模擬腸液），漩渦混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，在0 h和3 h（模擬腸液為4 h）采用平板計數(shù)法測定模擬胃液及模擬腸液處理前后的活菌數(shù)量，根據(jù)公式（1）計算菌株存活率。

式中：N1代表經(jīng)過模擬胃液（模擬腸液）處理后乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）；N0代表模擬胃液（模擬腸液）處理前的乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 膽鹽耐受實驗

取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，以2%接種量分別接種到膽鹽質(zhì)量濃度為0.1、0.3、0.5、1.0 g/100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)3 h后，采用MRS平板菌落計數(shù)法測定樣品中的菌體數(shù)目。以不加膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基作對照，存活率按照公式（1）計算，此時N1為處理組的乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）；N0為對照組的乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.4 抗氧化活性測定

通過DPPH自由基清除率以及總抗氧化能力評價屎腸球菌SC-Y112的抗氧化活性。乳酸菌無細(xì)胞上清液的制備：取10 mL活化后培養(yǎng)24 h的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取離心后的上清液過0.22 μm濾膜獲得乳酸菌無細(xì)胞上清液，4 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

總抗氧化能力的測定參照總抗氧化能力檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。DPPH自由基清除率測定：取150 μL乳酸菌無細(xì)胞上清液與150 μL DPPH-甲醇溶液（0.2 mmol/L）于96 孔酶標(biāo)板上混合，避光室溫反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測吸光度（A2），以體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液代替DPPH-甲醇溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組（A3），以體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液代替無細(xì)胞上清液的反應(yīng)體系為控制組（A1），以1 mmol/L VC溶液或MRS培養(yǎng)基代替無細(xì)胞上清液的反應(yīng)體系分別作為陽性或陰性對照組。所有樣品測定3 次，DPPH自由基清除率按式（2）計算。

1.3.5 溶血活性測定

取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落周圍是否有溶血的透明圈，以具有強(qiáng)溶血性質(zhì)的金黃色葡萄球菌F19作為陽性對照。若菌落周圍由于紅細(xì)胞的不完全破裂形成草綠色環(huán)，則為α溶血；若菌落周圍由于紅細(xì)胞的完全破裂形成界限分明、完全透明的溶血環(huán)，則為β溶血；若菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，為γ溶血，即不溶血[9]。

1.3.6 明膠液化實驗

取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，穿刺接種于含有5 mL明膠培養(yǎng)基的環(huán)氧樹脂管中，37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后，取出置于4 ℃冰箱中放置2 h以使剩余明膠完全凝固，同時設(shè)置陰性對照組（以無菌生理鹽水代替實驗菌）和陽性對照組（以金黃色葡萄球菌F19代替實驗菌），觀察管內(nèi)融化情況，出現(xiàn)明膠融化現(xiàn)象的試管判定為溶明膠的陽性反應(yīng)[10]。

1.3.7 有害代謝物質(zhì)檢測

乳酸菌產(chǎn)生物胺實驗：取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，分別在添加了前體氨基酸（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸）的改良氨基脫羧酶檢測平板和未添加前體氨基酸的檢測平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)并觀察顏色變化，顏色變?yōu)樽仙臑殛栃越Y(jié)果，顏色未變的為陰性結(jié)果[11]。

乳酸菌偶氮還原實驗：取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，劃線接種于含有直接藍(lán)71（終質(zhì)量濃度5 mg/L）的MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察是否有水解圈產(chǎn)生，有水解圈出現(xiàn)即為陽性。

吲哚實驗：取實驗菌株以2%接種量接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，滴加吲哚試劑，液面出現(xiàn)玫瑰紅色則為陽性結(jié)果，否則為陰性結(jié)果。實驗以大腸桿菌8099為陽性對照，以不接種菌液的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照。

1.3.8 耐藥性評價

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）推薦使用的紙片擴(kuò)散（Kirby-Bauer，K-B）法[12]測量8 種抗生素對屎腸球菌SC-Y112的抑菌圈直徑，對耐藥性進(jìn)行判定，藥敏實驗判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏紙片含藥量及抗性判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for determination of drug contents and resistance of drug sensitive paper

實驗菌株過夜活化，4 000 r/min離心10 min后去上清液，菌體重懸于適量無菌生理鹽水中，調(diào)整菌體濁度為0.5 個麥?zhǔn)蠁挝?。用無菌棉簽均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基表面，用滅菌鑷子取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)18～24 h后取出，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。使用Streptococcus pyogenesATCC 25923作為質(zhì)控菌株，質(zhì)控菌株抑菌圈直徑在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)實驗結(jié)果有效。

1.3.9 腸球菌毒力基因檢測

菌株過夜活化，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，擴(kuò)增Asa1、Asa373、ace、efaA、cylA、esp、hyl、gelE、sprE、fsrA、fsrB和fsrC共12 種腸球菌毒力基因，其中明膠酶E及其啟動子和調(diào)節(jié)基因根據(jù)GenBank中公布的明膠酶E毒力基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物序列及退火溫度信息參照表2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL、2×TaqMasterMix PCR預(yù)混酶12.5 μL、上/下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。每組實驗采用ddH2O代替DNA模板作為陰性對照。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，相應(yīng)溫度退火（表2）30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保溫備用。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的位置出現(xiàn)條帶即為含有該毒力基因，以本實驗室前期鑒定的攜帶hyl毒力基因的Enterococcus faecium467作為陽性對照。

表2 腸球菌毒力基因PCR擴(kuò)增引物序列及反應(yīng)條件Table 2 Primer sequences and reaction conditions used for polymerase chain reaction amplification of Enterococcus virulence genes

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)以3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌SC-Y112的模擬胃腸液耐受實驗分析結(jié)果

胃腸道環(huán)境是機(jī)體的“生物屏障”，益生菌需在胃腸道環(huán)境下存活才能在體內(nèi)發(fā)揮其益生功能，胃液pH值會隨著胃酸的分泌和消耗在1.5～5.0之間波動，胃液中還含有各種酶類，食物通過胃的時間一般為1～3 h[18]。小腸液呈弱堿性，且含有膽汁酸和酶（主要是胰蛋白酶），食物通過小腸的時間約為1.5 h。胃腸液中存在的酶和酸堿環(huán)境對乳酸菌有著較強(qiáng)的抑制作用。

表3展示了屎腸球菌SC-Y112對模擬胃腸液的耐受性：屎腸球菌SC-Y112在pH 2.0的模擬胃液中培養(yǎng)3 h的存活率為（73.66±4.37）%，展現(xiàn)出較高的耐受性；在pH 6.8的模擬腸液中培養(yǎng)4 h后，存活率為（119.63±3.71）%，菌株數(shù)量明顯升高，這可能是由于模擬腸液pH值呈中性，生長環(huán)境溫和，導(dǎo)致菌株數(shù)量的升高，該結(jié)果與李曉飛[19]的研究結(jié)果相一致。同時，李素霞[20]指出，產(chǎn)細(xì)菌素屎腸球菌分泌的抗菌蛋白可能與模擬腸液中的胰蛋白酶結(jié)合，從而消除部分胰蛋白酶對屎腸球菌的抑制作用，導(dǎo)致菌株快速增殖?？傮w而言，屎腸球菌SC-Y112對機(jī)體生理濃度范圍內(nèi)的模擬胃腸液具有良好的耐受能力，認(rèn)為其具備在體內(nèi)發(fā)揮其益生性質(zhì)的潛力。

表3 屎腸球菌SC-Y112的耐模擬胃腸液測定結(jié)果Table 3 Resistance of Enterococcus faecium SC-Y112 to simulated gastrointestinal fluid

2.2 屎腸球菌SC-Y112的耐膽鹽實驗分析結(jié)果

通過胃液后存活的菌株將在小腸的前部遇到膽鹽，因此，對膽鹽具有抗性是菌株能夠在腸道中生長、存活、發(fā)揮益生功效的一個重要指標(biāo)，腸道中膽汁的質(zhì)量濃度一般在0.1～0.3 g/100 mL范圍內(nèi)波動[21]。

實驗進(jìn)行了4 種不同膽鹽質(zhì)量濃度處理，結(jié)果如圖1所示，不同質(zhì)量濃度膽鹽對屎腸球菌SC-Y112具有不同程度的抑制作用，菌株在0.1 g/100 mL膽鹽質(zhì)量濃度下長勢良好，經(jīng)過3 h培養(yǎng)后，存活率達(dá)到99%以上；在膽鹽質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL時存活率仍達(dá)到56.38%，進(jìn)一步提升膽鹽質(zhì)量濃度至0.5 g/100 mL，其存活率降至25.73%；當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度升至1.0 g/100 mL時，通過平板菌落計數(shù)未發(fā)現(xiàn)活菌存在，表現(xiàn)出對菌株的強(qiáng)抑制作用。張芬[22]發(fā)現(xiàn)了一株嬰兒源屎腸球菌，其在1.0 g/100 mL膽鹽質(zhì)量濃度下存活率達(dá)75.06%，展現(xiàn)出對高濃度膽鹽的強(qiáng)耐受性，這可能是菌株來源與所處環(huán)境差異導(dǎo)致的?？傮w來說，屎腸球菌SC-Y112能在機(jī)體正常生理膽鹽質(zhì)量濃度下保持較高的存活率，具備良好的膽鹽耐受能力。

圖1 屎腸球菌SC-Y112的耐膽鹽測定結(jié)果Fig.1 Bile salt tolerance of Enterococcus faecium SC-Y112

2.3 屎腸球菌SC-Y112的抗氧化活性分析結(jié)果

氧化是生物界中普遍存在的化學(xué)反應(yīng)，氧化的過程總是伴隨著自由基的產(chǎn)生，過量的自由基易造成機(jī)體的氧化損傷，導(dǎo)致糖尿病、心血管疾病等[23]，而乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的一些活性物質(zhì)使乳酸菌具有一定的抗氧化活性，具有強(qiáng)抗氧化活性的乳酸菌株不僅能抑制機(jī)體自由基的形成，緩解機(jī)體氧化損傷，同時也能提高菌株耐受氧脅迫能力，利于其自身在腸道內(nèi)存活[24]。

以1 mmol/L VC和MRS培養(yǎng)基作為對照，通過DPPH自由基清除率和總抗氧化能力評價了屎腸球菌SC-Y112的抗氧化活性，結(jié)果如表4所示。屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵24 h上清液對DPPH自由基的清除率達(dá)到（37.68±2.16）%，其總抗氧化能力達(dá)到（35.21±0.09）U/mL，1 mmol/L VC和MRS培養(yǎng)基的總抗氧化能力分別為（98.55±3.14）U/mL和（3.36±1.47）U/mL。吳貝等[25]對一株益生性屎腸球菌DPPH自由基清除能力進(jìn)行評估，其發(fā)酵24 h上清液DPPH自由基清除率達(dá)56.5%，具備良好的抗氧化活性。綜合兩類測定方法，屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵24 h上清液總抗氧化能力的VC當(dāng)量為（0.36±0.04）mmol/L，具備一定的抗氧化能力。

表4 屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵液的抗氧化活性測定結(jié)果Table 4 Antioxidant activity of the fermentation supernatant of Enterococcus faecium SC-Y112

2.4 屎腸球菌SC-Y112的溶血活性分析結(jié)果

對乳酸菌株進(jìn)行溶血現(xiàn)象的測定是乳酸菌安全性評價的重要指標(biāo)之一。溶血實驗結(jié)果如圖2所示，實驗菌株劃線于哥倫比亞血瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)48 h后，陽性對照金黃色葡萄球菌F19菌落周圍出現(xiàn)透明圈，表現(xiàn)出明顯的β溶血。屎腸球菌SC-Y112菌落周圍既無透明圈也無草綠色環(huán)，屬于沒有毒性的γ溶血，即不溶血。這表明屎腸球菌SC-Y112在溶血作用方面是安全的，實驗結(jié)果與Charyyev等[26]對屎腸球菌Enterococcus faeciumYT52所進(jìn)行的溶血實驗結(jié)果一致。

圖2 屎腸球菌SC-Y112的溶血實驗結(jié)果Fig.2 Hemolysis test results for Enterococcus faecium SC-Y112

2.5 屎腸球菌SC-Y112的明膠液化分析結(jié)果

明膠酶是腸球菌合成的一種分泌蛋白酶，由毒力基因gelE編碼，被認(rèn)為是通過參與細(xì)胞膜形成，或降解機(jī)體中的膠原蛋白、纖維蛋白等重要物質(zhì)而發(fā)揮毒性作用[27]，為防止可能的安全隱患，對屎腸球菌SC-Y112進(jìn)行了明膠液化的評價。實驗結(jié)果顯示：屎腸球菌SC-Y112實驗組與無菌生理鹽水代替菌液的陰性對照組均未出現(xiàn)明膠液化現(xiàn)象。陽性對照中，金黃色葡萄球菌F19實驗組出現(xiàn)了明膠液化情況。明膠液化表型常與gelE等明膠酶相關(guān)基因共同檢測，以明確菌株致病性。李岱霞等[28]通過檢測375 株腸球菌的明膠酶相關(guān)調(diào)控基因，與其明膠液化表型作比對，發(fā)現(xiàn)兩者一致性較高，這也表明明膠液化實驗結(jié)果能夠在一定程度上評價腸球菌屬的安全性質(zhì)。

2.6 屎腸球菌SC-Y112的有害代謝物質(zhì)分析結(jié)果

部分乳酸菌株可能代謝產(chǎn)生氨基酸脫羧酶、偶氮還原酶、色氨酸酶等有害酶，這些代謝產(chǎn)物可能對機(jī)體健康與穩(wěn)定帶來潛在的安全隱患。實驗對屎腸球菌SC-Y112的有害代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，屎腸球菌SC-Y112無偶氮還原現(xiàn)象（圖3中未展示），如圖3所示，大腸桿菌8099賴氨酸脫羧酶檢測平板中出現(xiàn)紫紅色現(xiàn)象，且在吲哚實驗中出現(xiàn)玫瑰紅色，均呈陽性結(jié)果；屎腸球菌SC-Y112經(jīng)4 種氨基酸脫羧酶檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)后，無紫紅色產(chǎn)生，表明菌株無氨基脫羧酶活性，不產(chǎn)生酪胺、組胺、腐胺和尸胺4 種生物胺（圖3僅以酪胺為例，組胺、腐胺和尸胺結(jié)果未展示），且不代謝色氨酸產(chǎn)生有害物質(zhì)吲哚。Ino?lu等[29]從奶酪中分離得到28 株腸球菌，其中只檢測到2 株不產(chǎn)酪胺，本實驗中，發(fā)酵乳源屎腸球菌SC-Y112也未檢測到酪氨酸脫羧酶的產(chǎn)生，這可能是菌株不攜帶編碼酪氨酸脫羧酶基因，也有可能是由于菌株未能夠表達(dá)相關(guān)基因，后續(xù)研究將考慮檢測氨基酸脫羧酶等相關(guān)調(diào)控基因，進(jìn)一步確定菌株代謝產(chǎn)物的安全性質(zhì)。本實驗結(jié)果初步表明菌株具有一定的代謝產(chǎn)物安全性。

圖3 屎腸球菌SC-Y112的有毒代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.3 Results of the detection of toxic metabolites of Enterococcus faecium SC-Y112

2.7 屎腸球菌SC-Y112的耐藥性評價結(jié)果

選取了8 種常見抗生素進(jìn)行菌株的耐藥性質(zhì)評價，質(zhì)控菌株抑菌圈直徑均在允許范圍內(nèi)，實驗菌株耐藥結(jié)果如表5所示，萬古霉素對屎腸球菌SC-Y112的抑菌圈直徑達(dá)到（22.40±0.43）mm，達(dá)到敏感級別，但對青霉素等其他7 種抗生素具有耐藥性。目前針對益生菌作為飼用添加劑的耐藥性質(zhì)具有兩種不同觀點：一方面認(rèn)為耐藥菌株攜帶的耐藥基因可能轉(zhuǎn)移至動物體內(nèi)其他致病菌從而造成嚴(yán)重的耐藥性；另一方面認(rèn)為，耐藥性較強(qiáng)的菌株在腸道定植后，能夠較好地耐受后期服用的抗生素等藥物，從而能夠更長久地發(fā)揮其益生性質(zhì)。周娟娟等[30]通過對142 株腸球菌屬乳酸菌進(jìn)行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)屎腸球菌對大部分抗菌藥物具有耐藥性，本實驗選取的屎腸球菌SC-Y112也表現(xiàn)出多重耐藥性，關(guān)于腸球菌的使用安全性還需要進(jìn)行更為細(xì)致和深入的研究。萬古霉素屬于糖肽類抗生素，普遍被認(rèn)為是治療腸球菌感染的最后一道防線[31]，Maia等[32]通過對103 株食源性屎腸球菌進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有菌株均對萬古霉素敏感，本次研究結(jié)果證明屎腸球菌SC-Y112也對其具有高度敏感性。此外，菌株是否攜帶耐藥基因及可能存在的其他耐藥因素仍需進(jìn)一步實驗研究。

表5 屎腸球菌SC-Y112的抗生素敏感性實驗結(jié)果Table 5 Antibiotic sensitivity of Enterococcus faecium SC-Y112

2.8 屎腸球菌SC-Y112的腸球菌毒力基因檢測結(jié)果

腸球菌的致病性與毒力基因密切相關(guān)[33]，本研究對屎腸球菌SC-Y112的12 種常見毒力因子基因進(jìn)行了檢測，包括聚集物質(zhì)、腸球菌表面蛋白、腸球菌心內(nèi)膜炎抗原A、膠原蛋白黏附素、溶血素、透明質(zhì)酸酶和明膠酶E及相關(guān)調(diào)控基因。

毒力基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示，陽性對照菌Enterococcus faecium467在預(yù)估位置擴(kuò)增得到hyl（276 bp），屎腸球菌SC-Y112在各泳道均無目的條帶檢出，表明該菌不攜帶這些主要的腸球菌毒力基因，其中溶血素基因cylA檢測結(jié)果與不溶血表型相一致，明膠酶相關(guān)基因的檢測結(jié)果與明膠溶解實驗中不溶解明膠的表型結(jié)果一致。王送林[34]通過對40 株屎腸球菌進(jìn)行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)有52.5%的菌株不攜帶任何毒力基因，在檢測出毒力基因的屎腸球菌中，攜帶hyl和asa1毒力基因的菌株占據(jù)了絕大部分。Amaral等[35]通過對3 株屎腸球菌進(jìn)行了多種毒力基因檢測，均未檢測到毒力基因存在。在本實驗中，在屎腸球菌SC-Y112中同樣未檢測出任何常見毒力基因，初步認(rèn)為其具備一定的安全性，但更多不常見的毒力基因攜帶情況，仍需要進(jìn)一步檢測。

圖4 屎腸球菌SC-Y112毒力基因的電泳圖Fig.4 Electropherograms of Enterococcus faecium SC-Y112 virulence gene

3 結(jié) 論

本研究通過模擬腸胃液環(huán)境耐受實驗、抗氧化活性測定、溶血活性測定、明膠液化實驗、有害代謝物質(zhì)檢測、耐藥性評價及腸球菌毒力基因檢測，對屎腸球菌SC-Y112的體外益生性質(zhì)與安全性質(zhì)進(jìn)行分析評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌SC-Y112對模擬胃腸液耐受性強(qiáng)，在模擬胃液中培養(yǎng)3 h的存活率達(dá)到73.66%，在質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL的膽鹽培養(yǎng)下存活率達(dá)56.38%，其發(fā)酵24 h上清液總抗氧化活力達(dá)35.21 U/mL，菌株不代謝產(chǎn)生酪胺、組胺、腐胺和尸胺4 種生物胺，不產(chǎn)吲哚以及偶氮還原酶等有害物質(zhì)，無溶血現(xiàn)象，不溶解明膠，不攜帶12 種常見腸球菌毒力基因，對萬古霉素敏感，表明屎腸球菌SC-Y112具有一定的益生性以及相對安全性。本研究結(jié)果結(jié)合該菌株的抑菌特性，可為菌株的開發(fā)與利用提供理論參考。