陳啟航，文麗華，陳小娥,，方旭波，凌建剛，宣曉婷

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，浙江 寧波 315000）

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）味道鮮美、營養(yǎng)豐富，其貝肉是食用的主要部位[1-2]。傳統(tǒng)的扇貝加工工藝主要采用手工脫殼和加熱脫殼，其中手工脫殼存在脫殼效率低、貝肉完整性差的缺點(diǎn)，而加熱脫殼易導(dǎo)致蛋白變性[3-4]。超高壓技術(shù)高效方便、能耗低，不僅脫殼率較高，且不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)，是當(dāng)前食品加工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。目前國內(nèi)外學(xué)者對超高壓技術(shù)在扇貝中應(yīng)用的研究，主要集中在脫殼工藝[6-8]、保鮮包裝[9]、質(zhì)構(gòu)[10]等方面。鞏雪等[8-9]對扇貝的得肉率、持水率、總揮發(fā)性鹽基氮含量及菌落總數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)壓強(qiáng)300 MPa、保壓時(shí)間180 s時(shí)，扇貝的脫殼率和得肉率較高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)通過超高壓處理并存放8 d后，扇貝的保鮮指標(biāo)與未處理組相比，保鮮效果達(dá)到預(yù)期。孫少斌[10]通過比較超高壓處理與熱處理對扇貝的影響，發(fā)現(xiàn)扇貝經(jīng)過超高壓處理后口感方面比熱處理組鮮嫩。

肌原纖維蛋白屬于鹽溶性蛋白，是貝肉的重要組成部分，其生化特性和結(jié)構(gòu)的變化會對扇貝的食用品質(zhì)以及商品價(jià)值產(chǎn)生影響[11-13]。超高壓在提高脫殼效果的同時(shí)也能作用于蛋白等生物大分子，使其肌原纖維蛋白的生化特性發(fā)生一定程度變化，導(dǎo)致蛋白變性。葉韜等[14]利用超高壓技術(shù)處理小龍蝦蝦仁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超高壓處理后其肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性下降，表面疏水性上升。周果等[15]采用超高壓技術(shù)處理梭子蟹蟹肉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超高壓處理，蟹肉的肌原纖維蛋白總巰基含量呈現(xiàn)下降趨勢。因此，采用超高壓技術(shù)處理蝦夷扇貝貝肉的同時(shí)，除了研究超高壓工藝對扇貝脫殼效果的影響外，關(guān)注超高壓對其肌原纖維蛋白生化特性和結(jié)構(gòu)的影響也十分重要。

本實(shí)驗(yàn)以蝦夷扇貝為研究對象，通過超高壓處理，研究不同壓力對扇貝脫殼效果的影響，依據(jù)肌原纖維蛋白的含量、總巰基含量、羰基含量、表面疏水性、Ca2+-ATPase活力等指標(biāo)，分析超高壓對貝肉肌原纖維蛋白生化特性產(chǎn)生的影響，并利用圓二色光譜探討肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，完善超高壓技術(shù)在貝類脫殼中的應(yīng)用研究，為扇貝加工和相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活蝦夷扇貝購于寧波路林水產(chǎn)品交易市場；牛血清白蛋白 北京Solarbio公司；Ca2+-ATPase活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Tris-馬來酸、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、2,4-二硝基苯肼 上海Aladdin公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CQC2L-600型全液相超高壓設(shè)備 北京速原中天股份有限公司；MS105DU電子分析天平、Delta320 pH計(jì)瑞士Mettler Toledo儀器有限公司；H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ST-752s紫外-可見光分光光度儀 上海光譜儀器有限公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Biologic公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓處理樣品

將清洗干凈的蝦夷扇貝分裝在聚乙烯袋中，分別在150、200、250、300、350 MPa下處理3 min，溫度為20～25 ℃。另以手工脫殼（直接用手術(shù)刀手工脫殼）和蒸煮脫殼（鮮活扇貝100 ℃水蒸煮3～5 min）為對照組。將樣品標(biāo)記后，置于4 ℃下用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.3.2 脫殼效果指標(biāo)測定

1.3.2 .1 脫殼時(shí)間的測定

參考汪蘭等[16]的研究方法，對扇貝分別進(jìn)行手工脫殼、蒸煮脫殼和超高壓脫殼，記錄扇貝脫殼所用的時(shí)間，并計(jì)算出平均每只扇貝的脫殼時(shí)間。

1.3.2 .2 得肉率的測定

參考王敏[17]的研究方法，在超高壓處理后，貝肉用濾紙吸干并稱質(zhì)量，按式（1）和式（2）分別計(jì)算脫殼后貝肉與貝殼的質(zhì)量比（Rm-s）和脫殼后貝肉與整個扇貝的質(zhì)量比（Rm-t），通過Rm-s和Rm-t反映貝肉產(chǎn)出率。

式中：mm為脫殼后貝肉質(zhì)量/g；ms為脫殼后貝殼質(zhì)量/g；mt為脫殼前整個扇貝質(zhì)量/g。

1.3.3 肌原纖維蛋白特性及結(jié)構(gòu)的測定

1.3.3 .1 肌原纖維蛋白的提取與質(zhì)量濃度的測定

參照崔燕等[18]的方法對貝肉肌原纖維蛋白進(jìn)行提取與質(zhì)量濃度的測定。

1.3.3 .2 肌原纖維蛋白總巰基含量的測定

參考Benjakul等[19]的方法測定總巰基含量，并略作修改。取0.25 mL肌原纖維蛋白溶液，加入2.5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（含8 mol/L尿素，pH 8.0），充分混勻后，分別加入50 μL 0.01 mol/L的5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液，在40 ℃條件下水浴15 min，測412 nm波長處吸光度。使用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算總巰基含量。

1.3.3 .3 肌原纖維蛋白羰基含量的測定

參考Jia Guoliang等[20]的方法，對貝肉肌原纖維蛋白的羰基含量進(jìn)行測定。

1.3.3 .4 肌原纖維蛋白表面疏水性的測定

參考崔燕等[18]的方法，對貝肉肌原纖維蛋白的表面疏水性進(jìn)行測定。

1.3.3 .5 Ca2+-ATPase活力的測定

參考閆春子等[21]的方法，對貝肉肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活力進(jìn)行測定。

1.3.3 .6 圓二色光譜分析

取0.1 mg/mL提取的肌原纖維蛋白樣品，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行圓二色光譜掃描，以超純水作為空白。測定條件：0.1 cm石英樣品池，光徑0.1 cm、帶寬1 nm、測定溫度25 ℃、波長范圍190～250 nm、掃描速率0.5 nm/s，用平均殘基橢圓值[θ]表示圓二色光譜數(shù)據(jù)，單位為deg·cm2/dmol。通過儀器自帶的軟件計(jì)算出各條件下肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)單元的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)平行3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。應(yīng)用Origin Pro 8.5軟件繪圖，通過SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓對蝦夷扇貝脫殼效果的影響

經(jīng)過超高壓脫殼后得到的貝肉產(chǎn)出率可通過得肉率Rm-s和Rm-t反映,其中Rm-s表示脫殼后貝肉與貝殼的質(zhì)量比，反映貝肉的完整性，而Rm-t則表示脫殼后貝肉與整個扇貝的質(zhì)量比，反映貝肉的占比[17]。扇貝脫殼效率由脫殼時(shí)間反映，脫殼時(shí)間直接對扇貝的脫殼成本和生產(chǎn)效率產(chǎn)生影響[16]。表1展示了不同壓力條件下超高壓對扇貝脫殼效果的影響，可以看出，與蒸煮脫殼和手工脫殼相比，超高壓處理組脫殼時(shí)間顯著縮短（P＜0.05），并且得肉率相對較高。在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，隨著超高壓壓力的增加，脫殼時(shí)間先縮短后延長，而扇貝的得肉率則先提高后下降。當(dāng)壓力增加至250 MPa時(shí)，扇貝的脫殼時(shí)間最短，僅為7.25 s，而得肉率Rm-s和Rm-t最高，分別達(dá)88.55%和65.86%。分析原因可能是殼肉之間的組織蛋白因超高壓作用產(chǎn)生變性，在一定范圍內(nèi)，隨著壓力的不斷增大，蛋白變性程度越大，殼肉分離更容易，得肉率也隨之提升。超過250 MPa，扇貝得肉率呈下降趨勢，脫殼時(shí)間延長。原因可能是過高的壓力造成貝肉肌纖維蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，肌肉出現(xiàn)破裂損失，從而導(dǎo)致扇貝得肉率下降[8]。綜上所述，適當(dāng)?shù)膲毫l件能夠提高扇貝的得肉率和縮短脫殼時(shí)間。

2.2 超高壓對蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白氧化的影響

2.2.1 超高壓對肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的影響

如圖1所示，與手工脫殼相比，超高壓和蒸煮處理均使貝肉肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度顯著下降，其中蒸煮脫殼組貝肉肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度下降最為顯著（P＜0.05），僅為手工脫殼組的49.73%。說明蒸煮處理嚴(yán)重破壞了蛋白空間構(gòu)象，使蛋白變性。與蒸煮處理相比，超高壓處理相對溫和，能夠降低貝肉肌原纖維蛋白的損失。且隨著壓力的增加，貝肉肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度逐漸降低，超過250 MPa時(shí)，肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度下降趨勢加快。王芝妍等[7]研究了超高壓對中華管鞭蝦蝦仁肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的影響，結(jié)果表明當(dāng)超高壓壓力大于200 MPa時(shí)，肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度逐漸下降，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。葉韜等[14]在研究超高壓對小龍蝦蝦仁肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度影響時(shí)亦得到類似結(jié)果，認(rèn)為超高壓會引起蛋白質(zhì)變性和聚集，使肌原纖維蛋白的鹽溶性降低，導(dǎo)致肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度下降。

圖1 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的變化Fig.1 Changes in myofibrillar protein content in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.2 超高壓對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

由圖2可知，與手工脫殼組相比，蒸煮脫殼組的總巰基含量急劇下降，為35.3 nmol/mg，降低了29.54%，可能是加熱破壞蛋白分子之間的作用力，巰基暴露后易被氧化為二硫鍵，使蛋白發(fā)生聚集和變性，引起巰基含量下降[22]。當(dāng)壓力為150 MPa時(shí)，總巰基含量與手工脫殼組差異不顯著（P＞0.05）。壓力超過250 MPa時(shí)，其總巰基含量發(fā)生顯著變化（P＜0.05）。說明隨著壓力的增大，原本位于分子內(nèi)部的巰基在壓力的作用下暴露出來，從而導(dǎo)致氧化，因此總巰基含量減少。隨著壓力的增大，扇貝貝肉肌原纖維蛋白總巰基含量總體呈下降趨勢。這與周果等[15]的研究結(jié)果相似。

圖2 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白總巰基含量的變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.3 超高壓對肌原纖維蛋白羰基含量的影響

羰基的形成由自由基氧化修飾蛋白質(zhì)所引起，其含量變化可表征蛋白質(zhì)的氧化變性程度，含量越高表示蛋白氧化程度越高[23]。由圖3可知，超高壓和蒸煮脫殼處理后肌原纖維蛋白的羰基含量均顯著高于手工脫殼組（P＜0.05），蒸煮脫殼組羰基含量最高，比手工脫殼組升高了2.67 倍。羰基含量隨著壓力的增大逐漸上升，說明貝肉肌原纖維蛋白氧化變性程度也隨之更高。這與郭麗萍[24]的研究結(jié)果相似。

圖3 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig.3 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.4 超高壓對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露情況可由表面疏水性反映，表面疏水性越大說明基團(tuán)暴露越多[25]。由圖4可知，與手工脫殼組相比，150、200、250、300、350 MPa處理后扇貝貝肉肌原纖維溴酚藍(lán)結(jié)合量分別增加了0.30、0.34、0.39、0.51、0.70 倍（P＜0.05），說明扇貝的疏水基團(tuán)多數(shù)位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，表面疏水性低，在超高壓作用下，蛋白質(zhì)分子伸展，基團(tuán)逐漸外露，從而使表面疏水性上升。蒸煮脫殼組相較手工脫殼組，其表面疏水性增加了0.91 倍。這與李長樂[26]的研究結(jié)果相似。

圖4 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig.4 Changes in surface hydrophobicity of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.5 超高壓對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的影響

肌球蛋白結(jié)構(gòu)的完整性可由Ca2+-ATPase活性體現(xiàn)，肌球蛋白的穩(wěn)定程度會對肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響[15]。由圖5可知，超高壓處理組隨著壓力的升高，其肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活力呈下降趨勢。可能原因是超高壓處理使貝肉肌球蛋白頭部空間構(gòu)象發(fā)生變化，造成Ca2+-ATPase活力降低。超高壓處理組在150 MPa時(shí)Ca2+-ATPase活力與手工脫殼組無顯著差異（P＞0.05），但超過250 MPa時(shí)Ca2+-ATPase活力與手工處脫殼相比顯著降低（P＜0.05），其中350 MPa時(shí)Ca2+-ATPase活力比手工脫殼組降低了37.35%，說明壓力過高的情況下Ca2+-ATPase易失活。蒸煮脫殼組的Ca2+-ATPase活力急劇下降，比手工脫殼組降低了45.78%。這與閆春子等[21]的研究結(jié)果相似。

圖5 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活力的變化Fig.5 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.3 超高壓對蝦類扇貝貝肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜作為一種研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法，不僅快捷有效，而且能夠顯示生物大分子主鏈構(gòu)象信息[27-28]。由圖6可知，手工脫殼組扇貝貝肉肌原纖維蛋白在209 nm、221 nm波長附近出現(xiàn)兩個明顯的負(fù)峰，其主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)引起，是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[29-30]，說明α-螺旋結(jié)構(gòu)豐富。蒸煮脫殼組在209、221 nm波長附近出現(xiàn)的兩個負(fù)峰強(qiáng)度較弱，說明α-螺旋含量較低，蒸煮處理對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響較大。超高壓組在192 nm波長附近出現(xiàn)正峰，在209 nm、221 nm波長附近出現(xiàn)兩個負(fù)峰。在150～350 MPa處理3 min條件下，蛋白圓二色光譜中α-螺旋對應(yīng)的負(fù)峰強(qiáng)度降低，說明超高壓破壞了蛋白的有序結(jié)構(gòu)，α-螺旋結(jié)構(gòu)部分喪失。

圖6 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白圓二色光譜Fig.6 Circular dichroism spectra of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是多肽鏈利用氫鍵進(jìn)行折疊或盤旋，形成規(guī)則性和周期性的結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)這幾種[31-32]。由圖7可知，與手工脫殼組相比，超高壓脫殼和蒸煮脫殼處理均對扇貝貝肉肌原纖維蛋白的構(gòu)象單元組成產(chǎn)生一定程度的影響。在超高壓處理組中，150 MPa處理組肌原纖維蛋白中β-轉(zhuǎn)角、β-折疊與手工脫殼組相對含量基本接近。隨著施加壓力由150 MPa增至350 MPa，肌原纖維蛋白中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量逐漸降低、無規(guī)卷曲和β-折疊相對含量逐漸增加，說明壓力的增加使其結(jié)構(gòu)緊密程度下降，增加了其柔性，同時(shí)維持蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵結(jié)合作用減弱，其蛋白質(zhì)分子展開程度增加，從而對肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響[33-34]。無規(guī)卷曲相對含量的增加可能與蛋白分子中α-螺旋的展開有關(guān)[35]。當(dāng)壓力達(dá)到250 MPa后，隨著壓力繼續(xù)加大，α-螺旋相對含量下降，β-轉(zhuǎn)角相對含量降低的幅度較小，基本無明顯變化。相比而言，蒸煮脫殼組肌原纖維蛋白中的α-螺旋相對含量最低，無規(guī)卷曲相對含量高于手工脫殼組，表明蛋白緊密的螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)則狀態(tài)變化，引起蛋白質(zhì)的變性，蒸煮處理增強(qiáng)了扇貝貝肉肌原纖維蛋白的無序程度，對貝肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的破壞，超高壓狀態(tài)下其二級結(jié)構(gòu)相對更為有序。綜上所述，超高壓處理會對蛋白構(gòu)象產(chǎn)生一定影響。

圖7 不同處理?xiàng)l件下蝦夷扇貝貝肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的變化Fig.7 Changes in secondary structure contents of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

3 結(jié) 論

超高壓處理對蝦夷扇貝閉殼肌肌原纖維蛋白的生化特性和二級結(jié)構(gòu)造成了一定影響。綜合分析超高壓處理后扇貝的脫殼效率以及貝肉肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度、總巰基含量、羰基含量、表面疏水性、Ca2+-ATPase活力等指標(biāo)，可以看出，當(dāng)壓力處于150 MPa和200 MPa時(shí)，超高壓處理對貝肉肌原纖維蛋白的影響相對較低，在一定程度上維持了蛋白的功能特性。隨著壓力的升高，圓二色光譜圖中的兩個負(fù)峰逐漸消失，α-螺旋相對含量逐漸降低，當(dāng)壓力超過250 MPa時(shí)，α-螺旋相對含量呈下降趨勢。壓力增大時(shí)蛋白從緊密的螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)則狀態(tài)變化，蛋白分子內(nèi)疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度的氧化、變性及降解，影響了蛋白構(gòu)象。綜上所述，適宜的超高壓條件為250 MPa保壓處理3 min。本實(shí)驗(yàn)為研究扇貝貝肉肌原纖維蛋白的生化特性及結(jié)構(gòu)提供了一定的參考，進(jìn)一步拓寬了蝦夷扇貝及相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)思路。