王蒙蒙，寇宇星,2，周 笙，王莉倩，于修燭,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

食用油室溫氧化以不飽和脂肪酸的自動氧化為主，自動氧化以自由基為活性中間體，通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行[1-3]。不飽和脂肪酸（RH）被引發(fā)生成烷基自由基（R·），R·與氧氣反應(yīng)生成烷過氧自由基（ROO·），其性質(zhì)活潑，會攻擊新的RH產(chǎn)生R·，從而促進鏈增殖，其間伴隨脂質(zhì)氫過氧化物（ROOH）的生成和裂解，產(chǎn)生小分子物質(zhì)等，造成油脂酸敗變質(zhì)[4-6]?？寡趸瘎ㄈ缱杂苫宄齽?、單線態(tài)氧淬滅劑、金屬離子螯合劑）會降低油脂的氧化速率[7-10]；酚類化合物如特丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、生育酚（tocopherol，VE），可提供氫原子（H·）與ROO·或烷氧自由基（RO·）反應(yīng)，抑制鏈引發(fā)和增殖[11-13]。氧化助劑（如過渡金屬離子、葉綠素）會促進油脂氧化；偶氮二異庚腈（2,2'-azobis(2,4-dimethyl)valeronitrile，ADVN）熱分解引發(fā)的自由基與氧反應(yīng)生成過氧自由基，其會攻擊不飽和脂肪酸從而引發(fā)自動氧化反應(yīng)[14]；葉綠素可以激活單線態(tài)氧直接與脂肪酸的雙鍵加成生成氫過氧化物，或者通過提取氫質(zhì)子直接活化含烯物生成自由基，進而與氧反應(yīng)[15]。電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）結(jié)合自旋捕獲技術(shù)可用于檢測性質(zhì)活潑、不穩(wěn)定的自由基，直接有效且快速靈敏[16-18]，其在脂質(zhì)氧化方面應(yīng)用漸多。Chen Hongjian等[19]用EPR監(jiān)測140 ℃熱氧化的油酸，發(fā)現(xiàn)5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5,5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide，DMPO）-烷基自由基加合物是主要組成部分，EPR譜強度遠高于烷氧基。Xie Yunfei等[20]研究了花生油氧化過程中脂質(zhì)自由基變化，在90 ℃加速氧化過程中，油酸和亞油酸中所含自由基主要是R·，花生油中所含自由基主要是未知碳中心自由基（DMPO-X）和RO·。加入TBHQ和檸檬酸的花生油中自旋總數(shù)顯著降低[21]。適量濃度生育酚會抑制N-叔丁基-α-苯基硝酮脂質(zhì)加合物生成，過量則會促進生成[22]。此外，利用EPR中自由基急劇變化確定氧化誘導(dǎo)時間，也可判斷油脂的氧化穩(wěn)定性[23-26]。Liu Ying等[27]進行的50 h油炸實驗中，EPR結(jié)果與大豆油過氧化值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明EPR可以提供油炸體系脂質(zhì)氧化的有效信息。本研究通過EPR技術(shù)對不飽和脂肪酸室溫氧化過程自由基變化及TBHQ、VE、ADVN、葉綠素對其影響進行探究，結(jié)合不飽和脂肪酸核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）分析脂肪酸氧化變化，探究不飽和脂肪酸室溫氧化過程主要自由基的變化規(guī)律，并從自由基層面來明確抗/促氧化劑對其自動氧化的作用效果，為減輕不飽和脂肪酸氧化，延緩不同種類食用油氧化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油酸（分析純）、亞油酸（純度≥99.0%）、亞麻酸（純度≥99.0%）、DMPO、VE、TBHQ、ADVN阿拉丁試劑（上海）有限公司；甲苯（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

DMPO溶液的配制：將新購入的DMPO用甲苯溶解，使其終濃度為2.0 mol/L，置于棕色試劑瓶中，在－20 ℃冰箱中避光密封保存待用。

葉綠素制備：取5 g新鮮菠菜，去莖取葉，洗凈剪碎，放入研缽中充分研磨，用20 mL無水乙醇室溫浸泡1 h，過濾，得到葉綠素提取液。

1.2 儀器與設(shè)備

EMX plus-10/12 EPR儀 德國布魯克公司；Avance III型核磁共振波譜儀 布魯克（瑞士）公司。

1.3 方法

1.3.1 EPR分析

分別取3 mL的油酸、亞油酸、亞麻酸置于50 mL小燒杯中，使其暴露在空氣中，在室溫（20±2）℃下自然氧化，每隔30 min取200 μL樣品置于核磁管中，加入20 μL配好的DMPO溶液混勻，5 min后將核磁管置于達到設(shè)定溫度的EPR儀諧振腔內(nèi)進行測試。添加外源物實驗中，外源物的質(zhì)量分數(shù)為0.02%。

EPR儀測定條件：中心磁場為3 350.00 G；掃場寬度為100.00 G；掃場時間為20.0 s；微波功率為3.99 mW；調(diào)制幅度為1.000 G；轉(zhuǎn)換時間為10.00 ms；加熱溫度為373.15 K。

1.3.21H NMR分析

分別取5 mL的油酸、亞油酸、亞麻酸置于50 mL小燒杯中，使其暴露在空氣中，在室溫（20±2）℃下自然氧化5 h，取氧化前和氧化后的樣品各100 μL加入核磁管中，并用4 mL的CDCl3溶劑溶解，搖勻后測定1H NMR。

1H NMR測定條件參考李添寶等[28]的方法：每次測定都進行調(diào)諧、勻場；溫度297.3 K；500 MHz核磁共振儀的頻率500.13 MHz；氫譜譜寬10 330.578 Hz；掃描16 次；空掃2 次；每個核磁樣品管測定6 次；譜圖處理時以四甲基硅烷定位。

1.3.3 相關(guān)譜圖分析

EPR譜圖：以自由基的自旋朗德因子（g因子，也稱g值）為自由基譜圖中心點，通過Xenon軟件點擊譜圖中心點可以直接讀出g值，實驗中擬合到的自由基g值均為2.006。對樣品的自由基譜圖進行基線校正，校正后進行二次積分，使用Xenon軟件自帶的自旋定量功能，可得到該樣品的自旋總數(shù)和自由基濃度。通過Xenon軟件中的自旋擬合（Spin fit）功能對樣品的實驗譜圖進行計算機擬合，根據(jù)擬合得到的各自由基加合物的超精細耦合常數(shù)，確定自由基的種類，根據(jù)擬合譜圖中不同自由基的峰面積對其定量。

1H NMR譜圖使用Topspin軟件進行處理，譜圖經(jīng)校正零點后標(biāo)峰，并讀出峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)3 次以上，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不飽和脂肪酸室溫氧化過程自由基變化分析結(jié)果

2.1.1 油酸室溫氧化過程自由基變化分析結(jié)果

油酸的EPR譜圖經(jīng)擬合得到4 種自由基加合物：烷基自由基加合物（alkyl radical adducts，ARA）、烷氧自由基加合物（alkoxyl radical adducts，AORA）、烷過氧自由基加合物（alkyl peroxyl radical adducts，APRA）以及DMPO-X，DMPO-X通常被認為是DMPO氧化后產(chǎn)生的自由基，具體見圖1。

圖1 室溫光照過程的油酸氧化后EPR譜與其擬合譜Fig.1 Experimental and fitted EPR spectra of oleic acid oxidized under ambient light at room temperature

室溫光照下油酸氧化主要生成4 種自由基，分別是R·、RO·、ROO·以及DMPO-X，其各自的超精細耦合常數(shù)如表1所示。

表1 DMPO捕獲的自由基EPR參數(shù)Table 1 EPR parameters for radical adducts to 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide

油酸室溫氧化過程各自由基變化情況如圖2所示，室溫光照油酸氧化過程中各自由基的數(shù)量發(fā)生波動變化。氧化的前60 min R·數(shù)量較多，多于其他3 種自由基，隨氧化進行逐漸下降，210 min后R·一直保持相對最低的數(shù)量。RO·、ROO·和DMPO-X在氧化的前60 min數(shù)量大致相同，隨后呈現(xiàn)波動上升的變化趨勢，ROO·在90～300 min時數(shù)量是4 種自由基中最高的，氧化180 min之后，RO·的數(shù)量僅次于ROO·。

圖2 室溫光照油酸氧化過程中各自由基自旋數(shù)的變化Fig.2 Changes in the number of spins of free radicals in oleic acid during oxidation under ambient light at room temperature

2.1.2 亞油酸室溫氧化過程自由基變化分析結(jié)果

室溫氧化過程中亞油酸所含自由基種類與油酸類似，主要是R·、ROO·、DMPO-X和RO·，其各自超精細耦合常數(shù)見表1，各自由基變化情況如圖3所示。亞油酸中所含自由基主要是R·，ROO·數(shù)量次之，DMPO-X和RO·數(shù)量最少。與油酸相比，亞油酸中的各自由基數(shù)量在整個氧化過程中都是在一個比較低的范圍內(nèi)波動。

圖3 室溫光照亞油酸氧化過程中各自由基自旋數(shù)的變化Fig.3 Changes in the number of spins of free radicals in linoleic acid during oxidation under ambient light at room temperature

2.1.3 亞麻酸室溫氧化過程自由基變化分析結(jié)果

亞麻酸中的自由基主要由R·構(gòu)成，其超精細耦合常數(shù)見表1，RO·、ROO·由于數(shù)量過低與基線相差較小，難以擬合。如圖4所示，亞麻酸室溫氧化過程中，R·數(shù)量波動上升。

圖4 室溫光照亞麻酸氧化過程中R·自旋數(shù)的變化Fig.4 Changes in the number of spins of alkyl radicals in linolenic acid during oxidation under ambient light at room temperature

對比3 種脂肪酸的EPR結(jié)果可知，脂肪酸不飽和程度越高，越易發(fā)生自動氧化，其中R·的數(shù)量越高。在油脂的自動氧化過程中，R·主要存在于自動氧化的鏈傳遞階段，在這一階段不飽和脂肪酸中雙鍵旁亞甲基上的氫被奪取，形成大量的R·。因此，脂肪酸中的不飽和碳碳雙鍵越多，氧化時生成的R·自由基就越多。

2.2 不飽和脂肪酸氧化前后的核磁共振氫譜變化分析結(jié)果

1H NMR是表征脂質(zhì)初級和二級氧化產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)最常用的方法，其對于全面認識氧化過程和氧化機理有很大幫助。通過在氧化過程中監(jiān)測脂質(zhì)分子反應(yīng)位點的質(zhì)子峰，1H NMR可評估脂質(zhì)的氧化狀態(tài)[29-30]。不飽和脂肪酸氧化過程伴隨一系列不同化學(xué)環(huán)境的氫原子的變化，1H NMR能夠提供油脂中化合物的氫原子信息，有助于認識不飽和脂肪酸的氧化。亞麻酸、亞油酸、油酸氧化5 h前后的1H NMR譜如圖5所示。

圖5 室溫光照不飽和脂肪酸氧化5 h前后的1H NMR譜Fig.5 1H NMR spectra of unsaturated fatty acids before oxidation and after oxidation for 5 h under ambient light at room temperature

1H NMR譜中，δ＝0.85處峰歸屬為亞油酸和油酸末端—CH3上的氫，δ＝0.96處峰歸屬為亞麻酸末端—CH3上的H，δ＝1.3處峰歸屬為—CH2上的H（脂肪族亞甲基氫），δ＝1.60處峰歸屬為與—C＝O相隔一個—CH2上的H，δ＝2.0處峰歸屬為與—C＝C—雙鍵相鄰—CH2上的H（烯丙基氫），δ＝2.3處峰歸屬為和—C＝O直接相連—CH2上的H，δ＝2.8處峰歸屬為位于兩個—C＝C—雙鍵之間—CH2上的H（雙烯丙基氫），δ＝5.3處峰歸屬為—C＝C—雙鍵上的H，δ＝11處峰歸屬為羧羥基上的H[28]。δ＝7.26處峰屬于溶劑CDCl3。由圖5A、B可知，氧化前后亞麻酸中的H原子種類沒有發(fā)生明顯變化，僅數(shù)量略有變化。對比氧化前后1H NMR譜圖上各峰的面積積分結(jié)果可以看出，氧化后的亞麻酸中雙烯丙基氫質(zhì)子和烯丙基氫質(zhì)子的數(shù)量降低，表明亞麻酸（RH）被引發(fā)生成R·和H·；而雙鍵上的氫以及亞麻酸末端甲基上的氫數(shù)量均降低，表明H·與更為活躍的ROO·結(jié)合生成亞麻酸氫過氧化物（ROOH）后，部分亞麻酸氫過氧化物分解生成了其他小分子物質(zhì)，如醛、醇、烷烴等。對比圖5C、D可以看出，亞油酸氧化后，雙烯丙基氫質(zhì)子和烯丙基氫質(zhì)子數(shù)量略微降低，雙鍵氫數(shù)量也略微降低；對比圖5E、F可知，油酸中烯丙基氫、雙鍵氫以及脂肪族亞甲基氫數(shù)量略微降低；由此得出，亞油酸和油酸室溫氧化5 h可得到與亞麻酸一樣的結(jié)論，但亞油酸和油酸的氧化和降解程度較低于亞麻酸。

2.3 外源性物質(zhì)對不飽和脂肪酸室溫氧化過程自由基的影響

2.3.1 不同外源物對不飽和脂肪酸室溫氧化時自旋總數(shù)的影響

室溫氧化條件下油酸、亞油酸、亞麻酸中加入TBHQ、VE、ADVN、葉綠素后以及以光照組為對照組的自旋總數(shù)變化如圖6所示。

圖6 含不同外源物的不飽和脂肪酸中自旋總數(shù)隨時間的變化Fig.6 Changes in the number of spins in unsaturated fatty acids with different exogenous substances over time

由圖6A可以看出，加入VE的油酸中自旋總數(shù)較低，而其他4 個樣品的初始自旋總數(shù)相差不大。在氧化的0～120 min及240～300 min階段，添加VE的油酸其EPR信號很弱，通過EPR譜圖僅可觀察到R·的存在（EPR譜未列出），且其數(shù)量一直處于很低的水平，說明VE抑制油酸室溫氧化的能力較強。而在氧化中間階段（120～240 min），3 個時間點的實驗圖譜非典型脂類自由基的EPR圖譜無法擬合，推測可能是在這段時間存在較多的VE提供H原子后產(chǎn)生的α-生育酚自由基導(dǎo)致譜圖重疊太過嚴重而難以分析。而添加TBHQ的油酸在氧化0～60 min期間自旋總數(shù)偏高，之后自旋總數(shù)降低，在180～300 min期間維持在一個較低的水平。而加入ADVN的油酸則一直在一個相對較高的水平上波動。添加葉綠素的油酸在測試期間其自旋總數(shù)一直在一個較大的范圍內(nèi)波動，其原因可能是葉綠素激發(fā)了樣品中自由基的生成。由圖6B可知，加入TBHQ和VE的亞油酸初始自旋總數(shù)都較低，而且一直在較低的范圍內(nèi)波動，加入葉綠素和ADVN的亞油酸初始自旋總數(shù)相對較高，而對照組的初始自旋總數(shù)最高?？赡艿脑蚴莵営退岜扔退岫嘁粋€不飽和鍵，更易氧化，在非常短的時間內(nèi)樣品被激發(fā)產(chǎn)生了自由基。然而在樣品氧化的前30 min中，對照組的自旋總數(shù)下降幅度比較大，而其他幾組的自旋總數(shù)只是小幅度下降。而在氧化210 min后，由于ADVN的加入引入了CCRA，導(dǎo)致這一組的自旋總數(shù)較大，添加VE和TBHQ的亞油酸其自旋總數(shù)最小。甚至加入TBHQ的亞油酸樣品由于譜圖信號太弱無法進行擬合，而加入VE的亞油酸樣品也僅能擬合到R·，即VE組樣品自旋總數(shù)的變化基本上都來自于R·。由圖6C可以看出，加入TBHQ和VE的亞麻酸的初始自旋總數(shù)都比較低，而且在整個氧化過程中其自旋總數(shù)也一直在一個較低的范圍內(nèi)波動；加入葉綠素和ADVN的亞麻酸的初始自旋總數(shù)較高，且相對加入TBHQ和VE的亞麻酸，其波動范圍更大一些。

2.3.2 不同外源物對油酸室溫氧化時自由基的影響

由圖7A可知，加入TBHQ的油酸氧化過程中RO·、ROO·和DMPO-X都保持一個相對較低的數(shù)量，且變化幅度也較小。樣品中R·數(shù)量最高，其變化決定了樣品自旋總數(shù)的變化。而室溫光照油酸氧化過程（圖2）中數(shù)量最多的自由基是ROO·，其次是RO·，由此初步判斷TBHQ在加入油酸樣品之后抑制了RO·、ROO·的生成。結(jié)合TBHQ的抗氧化機理，可能原因是TBHQ在加入至樣品中后提供H·，其與RO·、ROO·結(jié)合形成ROOH以及其他更穩(wěn)定的化合物，抑制了鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進行，從而降低樣品中RO·、ROO·的數(shù)量。添加ADVN的油酸樣品中的自由基包括R·、ROO·、DMPO-X、RO·以及CCRA，其各自的超精細耦合常數(shù)見表1。由圖7B可以看出，在氧化前150 min，加入ADVN的油酸樣品中主要存在的自由基是R·，且R·氧化期間一直保持相對較高的數(shù)量。而其他4 種自由基在前150 min都數(shù)量較低，且RO·、ROO·和DMPO-X的數(shù)量一直保持較低的水平，而CCRA在150 min后數(shù)量急劇升高并超過R·，這類自由基可能是由于ADVN的加入而引發(fā)產(chǎn)生的。

圖7 油酸室溫氧化添加不同外源物質(zhì)后各自由基自旋數(shù)隨時間的變化Fig.7 Changes in the number of spins of individual free radicals in oleic acid with different exogenous substances during oxidation at room temperature

2.3.3 不同外源物對亞油酸室溫氧化時自由基的影響

添加VE和ADVN后亞油酸室溫氧化過程的自由基變化見圖8，添加VE的亞油酸譜圖整體信號偏弱，僅能擬合到R·，經(jīng)擬合得到的R·自旋數(shù)在很低水平上波動。添加ADVN的亞油酸譜圖中僅可擬合到R·和CCRA，其各自的超精細耦合常數(shù)見表1。與添加ADVN的油酸相比，其所含自由基缺少了RO·、ROO·。添加ADVN的亞油酸中R·和CCRA同油酸中的變化趨勢一致。由圖8還可以看出，CCRA在氧化0～210 min數(shù)量較低，210 min后數(shù)量激增，而R·一直保持在較低的水平上波動。加入葉綠素的亞油酸由于譜圖信號弱、雜質(zhì)多，導(dǎo)致譜圖難以解析，但可以看出葉綠素組的自由基是以R·為主。

圖8 亞油酸室溫氧化時添加不同外源物質(zhì)后各自由基自旋數(shù)隨時間的變化Fig.8 Changes in the number of spins of individual free radicals in linoleic acid with different exogenous substances during oxidation at room temperature

2.3.4 不同外源物對亞麻酸室溫氧化時自由基的影響

添加TBHQ、VE、ADVN、葉綠素后以及對照組的亞麻酸室溫氧化過程的自由基變化如圖9所示。光照下氧化的亞麻酸中僅擬合得到R·，在相同的檢測條件下，加入VE、葉綠素、TBHQ亞麻酸中的自由基組成與其類似，只有R·。由圖9A可知，對照組R·依舊保持波動增長的變化規(guī)律；VE組中的R·數(shù)量一直保持在一個相對較低的水平上，而TBHQ組由于自身引入了自由基，可能誘導(dǎo)了R·的生成，R·的數(shù)量在90 min增長到最大，隨后又下降并逐漸保持在比VE組略高的水平上。在亞麻酸中加入葉綠素，0～120 min期間誘導(dǎo)并促進了R·的生成，而在氧化120 min之后的階段，由于氧化的進行及活性物質(zhì)的消耗，該組R·的數(shù)量顯著降低，但仍高于VE和TBHQ組。添加ADVN的亞麻酸中所含自由基除R·外還有CCRA，其自旋數(shù)的變化見圖9B。在油酸和亞油酸樣品中加入ADVN，其CCRA數(shù)量都是前期較低，后期迅速增加到較高的水平。而在亞麻酸樣品中，ADVN引發(fā)的CCRA數(shù)量一直保持在較低的水平，擬合結(jié)果以R·占絕大多數(shù)，可能是由于亞麻酸自身極易氧化，從而形成了大量R·。

圖9 亞麻酸室溫氧化時添加不同外源物質(zhì)后各自由基自旋數(shù)隨時間的變化Fig.9 Changes in the number of spins of individual free radicals in linolenic acid with different exogenous substances during oxidation at room temperature

3 結(jié) 論

室溫光照下油酸和亞油酸的自動氧化主要生成4 種自由基，分別為R·、RO·、ROO·和DMPO-X，且其自由基總數(shù)一直處于一定的波動狀態(tài)。而在相同的檢測條件下，亞麻酸中的自由基主要是由R·構(gòu)成的，其自旋總數(shù)同樣處于波動狀態(tài)。這表明在相同測試條件下，越易氧化的脂肪酸中R·的比例越高。脂肪酸室溫氧化時，VE和TBHQ的加入會提供H·，其與自由基結(jié)合從而抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進行，尤其會抑制RO·、ROO·的形成，而且VE對R·生成也具有顯著抑制作用，導(dǎo)致樣品EPR信號太低，難以擬合或僅能觀察到R·的形成，VE和TBHQ可有效延緩不飽和脂肪酸自氧化的進程。在不飽和脂肪酸中加入ADVN時，自由基以R·為主，同時會引入CCRA，ADVN可加劇不飽和脂肪酸自動氧化的鏈引發(fā)階段。加入葉綠素的脂肪酸樣品整體自由基水平也比較高，葉綠素會加速不飽和脂肪酸的氧化進程。