黎曉菊，張曉梅△，庹呈杰，張科濤，秦杰琛，張 冰，黃之鐠，趙 慶△

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500)

病原微生物耐藥性一直是全世界關(guān)注的重大問題。隨著抗生素的濫用和超級耐藥菌的出現(xiàn)，細(xì)菌耐藥性對人類的危害越來越嚴(yán)重，感染性疾病死亡率也越來越高[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是一種最常見的耐藥病原菌，是臨床上非常棘手的治療難題?；颊咭坏└腥綧RSA，因其對目前臨床常用的抗生素多具有耐藥性，僅萬古霉素等少數(shù)有效，死亡率較高。然而，臨床已出現(xiàn)耐萬古霉素或敏感性下降的菌株[2-3]。所以，從天然產(chǎn)物及其衍生物中挖掘?qū)RSA安全有效的新型抗感染藥物，是人類面臨的緊迫任務(wù)。近年來，從傳統(tǒng)藥用植物中尋找新的抗菌成分，并對其抗菌機(jī)制進(jìn)行研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點。

姜屬(Zingiber)為姜科植物，我國有14種，多分布于西南部至東南部。姜屬植物大多以根莖入藥，具芳香或辛辣味[4]。生姜(Zingiber officinale Roscoe)是姜科姜屬植物，各地均產(chǎn)，至今已3000年的栽培歷史，是傳統(tǒng)的藥食同源植物。生姜性溫，味辛，歸肺、脾、胃經(jīng)，具有解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳等功效[5-7]。藥理研究表明，生姜具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)消化、改善血液循環(huán)、健胃止痛等功能[8-10]。生姜的化學(xué)成分主要包括黃酮類、姜辣素類、二苯基庚烷類、揮發(fā)油等[11-12]。已有研究表明，生姜提取物和精油具有較好的抗菌活性[13-15]。生姜的乙醇提取物能通過抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成而抑制其生長[16]。生姜中的[10]-姜辣素和[12]-姜辣素對3種與口腔牙周炎有關(guān)的厭氧菌有較強的抗菌活性[17]。此外，姜屬植物陽荷的揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌均有較強的抑菌活性[18]。姜屬植物Zingiber neesanum對腸球菌、魯西毛霉具有抑菌活性[15]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，藥材姜黃和紫色姜提取液經(jīng)光照后，其化學(xué)成分可能在姜黃素的催化下發(fā)生了光化學(xué)反應(yīng)，生成了新的產(chǎn)物，同時抗菌活性明顯增強[19]。這提示其它姜科植物的化學(xué)成分在姜黃素的催化下，有可能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，并得到抗菌活性增強的產(chǎn)物。為探究其它姜科植物是否也會在姜黃素的催化下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，本研究擬對生姜提取物進(jìn)行光照前后的化合物檢測及抗菌活性測試。前期通過薄層色譜分析生姜的化學(xué)成分，未檢測到姜黃素，因此在本實驗中創(chuàng)新性地加入姜黃素，并檢測光照前后的生姜提取物成分及抗菌活性變化。

1 材料與方法

1.1 藥材與藥品 市售的云南羅平生姜經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)馬偉光教授鑒定。生姜洗凈、切成薄片，晾干，粉碎后備用。姜黃素購買于阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與試劑 打粉機(jī)、研缽、超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋(TOMY公司)；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(AIRTECH公司)；LED燈(功率100 W，口徑8.5 cm，波長410～780 nm)。Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；色譜柱(Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm))；光二極管陣列檢測器(DAD)。培養(yǎng)基配料等常用試劑、耗材均購自雅云生物科技有限公司。有機(jī)溶劑：丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

1.3 指示菌 革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis1037)，糞腸球菌(Enterococcus faecalis ATCC-29212)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MR SA)：1450，1505，2024，1957，1591，28299，I-20，I-67，28300。革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)，鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)，克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia ATCC 13883)。真菌：白色念珠球菌(Candida albicans)，白色念珠球菌耐藥菌(Drug-resistant Candida albicans)：23#、63#、1730#、1725#、1732#。以上供試菌株均由課題組前期研究保存。

1.4 培養(yǎng)基 病原細(xì)菌培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，瓊脂 15 g，水 1 L，pH 7.2～7.6。真菌培養(yǎng)基沙保氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖 40 g，瓊脂 15 g，水 1 L，pH 6.0。

1.5 實驗方法

1.5.1 樣品處理 取姜黃素2份(各1.5 mg)于1 mL試樣瓶中，分別加入300 μL丙酮溶解(編號分別為Cur1、Cur2)，加蓋密封。將Cur2精密稱重并記錄重量，用LED燈光照4 h后再次稱重，用丙酮補重至原來的重量。Cur1放置暗處貯存。

取生姜干燥粉末30 g置于棕色瓶中，加入180 mL丙酮置于暗處浸泡12 h，超聲30 min，過濾，濾渣加90 mL丙酮超聲10 min，過濾，合并2次濾液，避光濃縮得浸膏。精密稱取3份浸膏，每份0.300 g，第1份浸膏用60 mL丙酮溶解，盛于250 mL錐形瓶，用LED燈光照4 h，濃縮，編號為ZO1。第2份浸膏中加入15.0 mg姜黃素，加入60 mL丙酮溶解，避光濃縮，編號為ZO2，置于暗處保存。第3份浸膏中加入15.0 mg姜黃素，加入60 mL丙酮溶解，盛于250 mL錐形瓶，用LED燈光照4 h，濃縮，編號為ZO3。

另取生姜干燥粉末10 g置于棕色瓶中，加入60 mL丙酮置于暗處浸泡12 h，超聲30 min，過濾，濾渣加30 mL丙酮超聲10 min，過濾，合并2次濾液，避光濃縮得浸膏。精密稱取2份浸膏，每份0.150g。在第1份浸膏中加入7.5 mg姜黃素，加入20 mL丙酮溶解，濃縮，用甲醇溶解，定容于25 mL棕色容量瓶中，編號為ZO2a，置于暗處保存。第2份浸膏中加入7.5 mg姜黃素，加入20 mL丙酮溶解，盛于150 mL錐形瓶，用LED燈光照4 h，濃縮，用甲醇溶解，定容于25 mL棕色容量瓶中，編號為ZO3a。

1.5.2 抗菌活性測試 病原菌接種至液體LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min黑暗培養(yǎng)12 h；白色念珠菌及其耐藥菌接種至液體沙保氏培養(yǎng)基，28℃、200 r/min黑暗培養(yǎng)24 h。用液體培養(yǎng)基將各菌液分別稀釋至1×106～1×107cfu/mL備用。采用抗菌紙片擴(kuò)散法[20]，對 1.5.1 的 5 個樣品(Cur1、Cur2、ZO1、ZO2、ZO3)進(jìn)行抗菌活性測試。

將稀釋后的指示菌菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，稱取1.5.1中的ZO1、ZO2、ZO3各90 mg，分別加入 900 μL 丙酮溶解至質(zhì)量濃度為 100 μg/μL，分別取10 μL溶液于直徑5 mm的圓形濾紙片上，直至濾紙片將提取液完全吸收后貼于接種好指示菌的固體培養(yǎng)基上，每份提取液平行做3組。以10 μL丙酮做空白對照，以抗生素做陽性對照(革蘭氏陽性菌以芐基青霉素為陽性對照，革蘭氏陰性菌以卡那霉素為陽性對照，真菌以氟康唑為陽性對照；每個濾紙片上的抗生素質(zhì)量為50 μg)。真菌在28℃下培養(yǎng)，其余病原細(xì)菌于37℃培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

分別取1.5.1中的Cur1、Cur2溶液10 μL于直徑5 mm的圓形濾紙片上，直至濾紙片溶液完全吸收后貼于接種好指示菌的固體培養(yǎng)基上，每份溶液平行做3組，按照2.2.1的方法進(jìn)行抗菌活性測試。

1.5.3 TLC檢測加入姜黃素的生姜提取液光照前后化學(xué)成分變化 將1.5.1中的樣品ZO2、ZO3各取2 mg，溶于0.5 mL丙酮，用毛細(xì)管分別吸取上述溶液各5 μL，在硅膠GF254板上點樣后，以石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)展開，分別以過氧化物顯色劑[21]及10%硫酸-乙醇顯色，拍照記錄薄層色譜結(jié)果。

1.5.4 HPLC檢測加入姜黃素的生姜提取液光照前后化學(xué)成分變化 將1.5.1中的樣品ZO2a與ZO3a用高效液相色譜分析。流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～30 min，35%～70%A；30～50 min，70%～90%A；50～60 min，90%A)。體積流量 1 mL/min，柱溫 30℃，進(jìn)樣量 5 μL。

2 結(jié)果

2.1 抗菌活性測試結(jié)果 采用紙片擴(kuò)散法，對未經(jīng)光照的姜黃素溶液Cur1和經(jīng)過光照的姜黃素溶液Cur2進(jìn)行抗菌活性測試，采用23種病原菌菌株。測試結(jié)果表明：無論是否經(jīng)過光照，姜黃素試樣對所測試的23株病原菌均未顯示抑菌活性，結(jié)果見表1。

采用紙片擴(kuò)散法，對未加入姜黃素、經(jīng)過光照的生姜提取物ZO1，加入姜黃素未經(jīng)光照的生姜提取物ZO2，加入姜黃素并經(jīng)光照的生姜提取物ZO3，進(jìn)行抗菌活性測試，采用23種病原菌菌株。測試結(jié)果見表1 和圖 1。測試結(jié)果表明：(1)ZO1、ZO2、ZO3 對所測試的23種病原菌具有廣譜抗菌活性。ZO1、ZO2對多數(shù)菌株的抗菌活性較弱(抑菌圈＜10 mm)，僅對MRSA2024、恥垢分枝桿菌1037的活性較強(抑菌圈＞10 mm)。ZO3對金黃色葡萄球菌、9個MRSA、恥垢分枝桿菌的抑制活性較強(抑菌圈＞10 mm)，對其它菌株的抑制活性較弱(抑菌圈＜10 mm)。(2)ZO3對9種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA1450、1505、2024、1957、28299、28300、1591、I-20、I-67) 的抑制活性遠(yuǎn)高于ZO1、ZO2。ZO3對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)的抑制活性也明顯高于ZO1、ZO2。(3)ZO3對恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis1037)的抑制活性遠(yuǎn)高于ZO1、ZO2；ZO3對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)的抑制活性略高于ZO1、ZO2；對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis ATCC-29212)的抑制活性與 ZO1、ZO2相當(dāng)。(4)ZO1、ZO2、ZO3對3種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、鮑曼不動桿菌、克雷伯氏菌)有較弱的抑制活性。(5)ZO1、ZO2對3種白色念珠菌耐藥菌無抑制活性，對2種白色念珠菌耐藥菌僅有微弱的抑制活性；而ZO3對上述5種菌株的其中4種，抑制活性均明顯高于ZO1、ZO2。

表1 各個測試樣品的抑菌圈直徑

圖1 ZO1、ZO3對MRSA-1957抑菌圈對比

綜上，生姜提取液加入姜黃素并經(jīng)光照后，不僅對23株病原菌都有抑菌活性，而且對多數(shù)病原菌的抑菌活性顯著提高，特別是對MRSA的抑制活性都顯著增強。與課題組前期研究中的姜黃、紫色姜相比[19]，加入姜黃素并經(jīng)光照的生姜提取液抗菌活性比前二者更強(特別是對MRSA)，對革蘭氏陽性菌的抗菌譜更廣。

2.2 薄層色譜檢測加入姜黃素的生姜提取物光照后的化學(xué)成分變化 通過薄層色譜法對加入姜黃素未經(jīng)光照的提取物ZO2與加入姜黃素并經(jīng)光照的提取物ZO3進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，未經(jīng)光照的ZO2檢測不到過氧化物，而經(jīng)過光照的ZO3可檢測到多個過氧化物(圖2A)。此外，采用10%硫酸-乙醇顯色劑時，ZO2與ZO3也有明顯不同(圖2B)。由此可見，姜黃素在光照下催化生姜化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生一系列氧化產(chǎn)物。

圖2 加入姜黃素的生姜提取物光照前后的薄層色譜圖

2.3 高效液相色譜法檢測加入姜黃素的生姜提取物光照后的化學(xué)成分變化 用高效液相色譜法對加入姜黃素未經(jīng)光照的生姜提取物ZO2a，與加入姜黃素并經(jīng)光照的生姜提取物ZO3a進(jìn)行檢測(在205nm與254nm的檢測結(jié)果見圖3、圖4)。根據(jù)色譜圖分析，在光照前后，化學(xué)成分發(fā)生了明顯的變化，說明可能發(fā)生了光化學(xué)反應(yīng)。

圖3 加入姜黃素的生姜提取物光照前后的高效液相色譜圖（檢測波長205nm）

圖4 加入姜黃素的生姜提取物光照前后的高效液相色譜圖（檢測波長254nm）

3 討論

姜黃素溶液無論是否經(jīng)過光照，對23株病原菌株均未顯示抗菌活性。因此在后續(xù)的實驗中，抗菌活性的產(chǎn)生可歸因于生姜中的化學(xué)成分及光照后的光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物，而不是姜黃素。ZO1組與ZO3組雖然二者都經(jīng)過光照，但前者未加入姜黃素，后者加入了姜黃素。ZO2組與ZO3組雖然二者都加入了姜黃素，但前者未經(jīng)過光照，后者經(jīng)過光照處理。ZO3組的對大多數(shù)菌株的抗菌活性顯著高于ZO1和ZO2組，由此可見：加入姜黃素和光照，對抗菌活性的改變起到了至關(guān)重要的作用，這2個因素缺一不可。加入姜黃素并經(jīng)光照的ZO3組，對多數(shù)革蘭氏陽性菌的抗菌活性有顯著提高，特別是對一系列耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以及恥垢分枝桿菌的抗菌活性的提高幅度很大；對3種革蘭氏陰性菌的抑制活性影響較??；對多數(shù)白色念珠菌耐藥菌的抑制活性有少許提高。

ZO2組與ZO3組的薄層色譜與高效液相色譜均有較為明顯的差別，這表明姜黃素可催化生姜的一些化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。

耐藥菌的出現(xiàn)和蔓延是全球關(guān)注的重大問題，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，已成為醫(yī)院感染和社區(qū)感染的一種最常見病原菌，嚴(yán)重危害人們的身體健康。將姜黃素加入生姜提取液中，使其催化生姜化學(xué)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，這尚屬課題組的首創(chuàng)。且生姜提取物經(jīng)過光化學(xué)反應(yīng)后，顯示了較強的抗菌活性，特別是對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抗菌活性有極大提高。下一步，我們將采用HPLC-MS初步判斷光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)成分的類型，再通過活性追蹤尋找有價值的活性化合物。此研究工作將為抗MRSA的天然藥物研究與開發(fā)提供新的途徑。