周 薏，葛冰景，肖鐵剛，曹紅燕，戴彥成，闕任燁

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脾胃病科，上海 200082)

肝纖維化是一種動(dòng)態(tài)可逆性的病理過(guò)程，若未采取有效措施進(jìn)行干預(yù)，甚至可進(jìn)展為肝硬化，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。肝臟鐵過(guò)載在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中具有重要作用，它能夠誘發(fā)或加重疾病的發(fā)展，隨著鐵過(guò)載的持續(xù)，最終可導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌發(fā)生[1-2]。臨床上使用鐵螯合劑也顯示出明顯的改善肝纖維化指標(biāo)作用[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為鐵是體內(nèi)的精微物質(zhì)之一，而精微物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)離不開(kāi)脾之運(yùn)化功能和肝之疏泄功能的正常發(fā)揮。因此，鐵代謝紊亂反映的是肝失疏泄，脾運(yùn)失常。臨床上肝纖維化或肝硬化患者常常存在肝失疏泄，脾運(yùn)無(wú)權(quán)等情況，以致不能將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至血液循環(huán)中為造血器官所利用，引起貧血，并沉積于肝臟等器官，引起纖維化的發(fā)生。故肝纖維化的治療應(yīng)著眼于疏肝健脾。逍遙散是中醫(yī)學(xué)疏肝健脾的經(jīng)典名方，由四逆散及當(dāng)歸芍藥散化裁而成。有多項(xiàng)臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明逍遙散具有抗肝纖維化的作用[4-6]，但其機(jī)制尚不明確。本課題組前期通過(guò)對(duì)逍遙散聯(lián)合恩替卡韋治療肝郁脾虛型乙肝后肝硬化代償期患者的隨機(jī)對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，逍遙散具有顯著的改善纖維化作用，并能夠改善患者機(jī)體的鐵過(guò)載水平。因此，本研究擬通過(guò)右旋糖酐鐵誘導(dǎo)鐵過(guò)載所致大鼠肝纖維化模型，觀察逍遙散的抗肝纖維化作用是否與調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵代謝平衡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD成年大鼠，56只，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院無(wú)特異病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房，恒溫(25±2)℃恒濕，人工光照12 h，黑暗12 h，自由進(jìn)食飲水，本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程遵循“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)愛(ài)和使用指南”。

1.1.2 試劑 COL-1、α-SMA免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物科技有限公司，蘇木素-伊紅染色液(P031IH)購(gòu)于湖南艾佳生物科技股份有限公司，Masson染色液(G1340)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，天狼星紅染色液(DC0041)購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司，鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 μg/mL由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。

1.1.3 藥物配制 逍遙散準(zhǔn)確稱(chēng)取柴胡15 g，當(dāng)歸15 g，白芍 15 g，白術(shù) 15 g，茯苓 15 g，甘草 7.5 g，粉碎成粗粉，加水1 500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入5 g煨姜和5 g薄荷，再保持沸騰煎煮10 min，煎煮液過(guò)5層紗布，濾液濃縮至2 g/mL(按生藥量計(jì))，經(jīng)冷凍干燥制成粉末，用前以蒸餾水配制成混懸液。去鐵胺配置成濃度為0.45 g/kg的去鐵胺溶液，逍遙散各拆方組按逍遙散去疏肝藥組(去柴胡、薄荷)、逍遙散去健脾藥組(去茯苓、白術(shù)、甘草)、逍遙散去養(yǎng)血藥組(去當(dāng)歸、白芍)制作藥物混懸液，方法同上。

1.1.4 儀器 快速研磨儀JXFSTPRP-48(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，多功能酶標(biāo)儀Varioscan Flash(上海百基生物科技有限公司)，RM2016切片機(jī)(萊卡公司)，生物組織攤烤片機(jī)YT-6C(亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，防脫載玻片P031IH(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，鼓風(fēng)干燥箱DHC-9070A(天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司)，光學(xué)顯微鏡AE41(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，AU400型全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，JENA AA400型原子吸收分光光度計(jì)(德國(guó)JENA儀器公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及模型建立 將56只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、逍遙散全方組、逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組、去鐵胺組，模型制作方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，每日予腹腔注射50 mg/kg右旋糖酐鐵，連續(xù)7周，對(duì)照組予腹腔注射同等劑量的生理鹽水。各藥物干預(yù)組在造模同時(shí)給予灌胃各組對(duì)應(yīng)的治療藥物10 mL/(kg·d-1)灌胃，對(duì)照組及模型組按體質(zhì)量給予灌胃等量生理鹽水。所有組大鼠7周后處死，取血清、肝組織標(biāo)本。血清標(biāo)本用蛋白酶抑制劑處理，-20℃中保存?zhèn)溆?；用全自?dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、SI、SF。肝組織標(biāo)本用含0.01%DEPC的生理鹽水清洗后保存于-80℃中，部分標(biāo)本用中性福爾馬林固定12 h后經(jīng)石蠟包埋，3～5 μm厚連續(xù)切片備檢。

1.2.2 肝臟病理組織檢查 病理組織學(xué)采用HE染色、Masson染色、苦味酸-天狼星染色3種染色方法，取備檢石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、染色、分化、透明、封片、鏡檢，分別觀察病變與纖維化程度，使用Ishak評(píng)分對(duì)HE染色切片進(jìn)行量化比較，ImagePro Plus軟件進(jìn)行半定量分析Masson染色、苦味酸-天狼星染色結(jié)果。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)α-SMA及COL-1表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復(fù)冷卻后，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，血清封閉，孵育一抗、孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片、鏡檢，觀察α-SMA及COL-1表達(dá)，并使用ImagePro Plus軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 大鼠肝臟總鐵含量檢測(cè) 按照文獻(xiàn) [8]報(bào)道，采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)所涉及數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料或計(jì)數(shù)資料采用中位數(shù)(M)、四分位數(shù)(Q)表示；對(duì)于計(jì)量資料，符合正態(tài)分布且方差齊者，采用One-way ANOVA LSD統(tǒng)計(jì)方法處理數(shù)據(jù)，對(duì)于計(jì)數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，最終結(jié)果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清肝損傷指標(biāo)檢測(cè) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P＜0.05)，逍遙散全方及各功效拆方組均可顯著抑制慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損害，陽(yáng)性對(duì)照藥與逍遙散全方組結(jié)果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝功能的影響

2.2 大鼠肝臟病理組織學(xué)檢測(cè) HE染色顯示對(duì)照組無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞多，膽管少，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯脂肪浸潤(rùn)。模型組可見(jiàn)匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈與肝血竇擴(kuò)張淤血，匯管區(qū)纖維組織增生，肝小葉間膽管明顯增生，部分分割包繞形成假小葉，Ishak評(píng)分較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組與模型組比較均有不同程度的改善作用，Ishak評(píng)分均有不同程度的降低(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥與逍遙散全方組結(jié)果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖 1、表2。

圖1 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理組織學(xué)HE染色的影響（×100）

Masson染色及苦味酸-天狼星紅染色可見(jiàn)對(duì)照組僅在中央靜脈壁和匯管區(qū)間有極少量膠原纖維沉積，模型組可見(jiàn)膠原纖維沉積顯著增加，增生的小膽管及其周?chē)哪z原纖維形成間隔，部分與臨近的增生間隔相互連接、包繞、分割，形成假小葉(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組對(duì)膠原纖維增生均有不同程度的明顯減輕，纖維間隔變窄，假小葉形成減少(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥與逍遙散全方組結(jié)果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖 2、圖 3，表 2。

圖2 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理組織學(xué)Masson染色的影響（×100）

圖3 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理組織學(xué)苦味酸-天狼星紅的影響（×100）

表2 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理組織學(xué)的影響

2.3 大鼠肝臟免疫組織化學(xué)檢測(cè) 對(duì)照組僅見(jiàn)極少量α-SMA和COL-1表達(dá)，模型組可見(jiàn)在匯管區(qū)、纖維間隔區(qū)α-SMA和COL-1明顯表達(dá)(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組α-SMA和COL-1表達(dá)均有不同程度的明顯降低(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥與逍遙散全方組結(jié)果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖4、圖5、表3。

圖4 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化免疫組化α-SMA表達(dá)的影響（×100）

圖5 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化免疫組化COL-1表達(dá)的影響（×100）

表3 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化免疫組化的影響

2.4 大鼠鐵代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 與對(duì)照組相比，模型組血清鐵、鐵蛋白及肝臟總鐵含量均顯著升高(P＜0.05)。逍遙散全方及各功效拆方組血清鐵、鐵蛋白及肝臟總鐵含量均有不同程度的明顯降低(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥與逍遙散全方組結(jié)果相仿(P＜0.05)。逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組相比，療效均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 逍遙散及各功效拆方對(duì)慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化鐵代謝指標(biāo)的影響

3 討論

肝纖維化是一種動(dòng)態(tài)可逆性的病理過(guò)程，若未采取有效措施進(jìn)行干預(yù)，甚至可進(jìn)展為肝硬化，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。因此，在肝纖維化階段及早采用藥物進(jìn)行有效干預(yù)，是防治肝硬化的重要治療策略。西醫(yī)學(xué)對(duì)肝纖維化、肝硬化迄今沒(méi)有滿意的治療方法。所以，尋找有效的治療手段仍是防治肝硬化研究領(lǐng)域的難點(diǎn)及熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝硬化發(fā)病早期病位常常在肝，隨著病情的不斷惡化與進(jìn)展，最終使脾腎受累。肝硬化其病理因素一般為氣滯、血瘀、水濕，這三者往往互為因果，相互為病，致使疾病錯(cuò)綜復(fù)雜，因此肝硬化一旦到晚期則殊難治療，預(yù)后較差。綜上所述，臨床上肝郁脾虛證在乙肝后肝硬化代償期時(shí)較為多見(jiàn)，而針對(duì)這一時(shí)期進(jìn)行有效的規(guī)范化治療能夠取得較好的效果。

肝臟是體內(nèi)主要的鐵貯存部位，在對(duì)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起著中心和樞紐的作用。鐵過(guò)載引起的肝損傷在多種急慢性肝損傷疾病或動(dòng)物模型引起的肝纖維化中均可能出現(xiàn)，如酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝炎，CCL4、DMN等毒性藥物引起肝纖維化，遺傳性血色病，丙型肝炎等[9-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎、乙肝后肝硬化患者血清中鐵含量、總鐵結(jié)合力、鐵蛋白等指標(biāo)均較健康人顯著升高，且與疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[15-16]。因此，有理由相信，鐵代謝紊亂在肝纖維化、肝硬化發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。

中醫(yī)學(xué)未有對(duì)鐵的直接描述，而可以認(rèn)為鐵是體內(nèi)的水谷精微物質(zhì)之一，而精微物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)離不開(kāi)脾之運(yùn)化功能及肝之疏泄功能的正常發(fā)揮。正如羅梅宏等[17-18]發(fā)現(xiàn)脾運(yùn)無(wú)力在缺鐵性貧血的發(fā)病過(guò)程中的具有重要作用，通過(guò)臨床與實(shí)驗(yàn)皆證實(shí)了通過(guò)運(yùn)脾法能夠顯著調(diào)節(jié)機(jī)體的鐵代謝平衡。因此可以理解為中焦脾胃在精微物質(zhì)鐵的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及最終參與生成血液的過(guò)程中有著十分重要的作用，故而有“脾胃是氣血生化之源”之說(shuō)。而肝臟主疏泄而藏血，在血液形成過(guò)程中亦有舉足輕重的作用。水谷精微源于脾胃，脾胃納化水谷，輸布精微，賴肝氣為之疏泄。故《血證論》說(shuō)：“食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之而水谷乃化?！币虼耍F代謝紊亂反映的是肝失疏泄和脾運(yùn)失常。臨床上肝纖維化或肝硬化患者常常存在肝失疏泄和脾運(yùn)無(wú)權(quán)等情況，以致不能將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至血液循環(huán)中為造血器官所利用，引起貧血，并沉積于肝臟等器官，引起纖維化的發(fā)生，故在治療上應(yīng)著眼于疏肝健脾。

逍遙散是中醫(yī)學(xué)疏肝健脾的經(jīng)典名方，在臨床上廣泛應(yīng)用于慢性肝炎、肝硬化、膽石癥、胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎、胃腸神經(jīng)官能癥、經(jīng)前期緊張癥、乳腺小葉增生。課題組前期通過(guò)對(duì)逍遙散聯(lián)合恩替卡韋治療肝郁脾虛型乙肝后肝硬化代償期患者的隨機(jī)對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，逍遙散具有顯著的改善纖維化作用，并能夠改善患者機(jī)體的鐵過(guò)載水平[19]。基于此我們提出了指導(dǎo)進(jìn)一步研究的假說(shuō)：逍遙散通過(guò)疏肝健脾之法調(diào)節(jié)機(jī)體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，又通過(guò)其養(yǎng)血之能，促進(jìn)鐵利用?？偠灾?，其疏肝、健脾、養(yǎng)血之功效均參與了對(duì)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。為此我們開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作，結(jié)果表明，逍遙散能顯著改善慢性鐵過(guò)載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，主要表現(xiàn)在降低血清ALT、AST水平，改善纖維化病理表現(xiàn)及抑制肝星狀細(xì)胞活化指標(biāo)如α-SMA和COL-1表達(dá)。而逍遙散的這些作用也已在其他肝纖維化模型中所證實(shí)[20-21]。而我們進(jìn)一步檢測(cè)了各組大鼠血清中鐵及鐵蛋白含量及肝臟總鐵含量的變化，發(fā)現(xiàn)逍遙散可顯著減大鼠體內(nèi)鐵過(guò)載水平。隨后我們又通過(guò)功效拆方，將逍遙散全方中疏肝藥(柴胡、薄荷)、健脾藥(茯苓、白術(shù)、甘草、生姜)、養(yǎng)血藥(當(dāng)歸、白芍)進(jìn)行拆解研究，結(jié)果表明逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組與逍遙散全方組在改善肝細(xì)胞損傷、纖維化及鐵過(guò)載方面均有顯著差異，提示整方無(wú)論去除疏肝藥、健脾藥或養(yǎng)血藥均對(duì)整方療效有顯著影響，換而言之，逍遙散中疏肝、健脾、養(yǎng)血之功效都參與了機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)進(jìn)而發(fā)揮了抗肝纖維化的作用。

綜上所述，中藥復(fù)方逍遙散是臨床上疏肝健脾的代表方劑，其疏肝、健脾、養(yǎng)血功效均與維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)，因此有理由相信，其能夠重塑肝臟鐵穩(wěn)態(tài)進(jìn)而發(fā)揮其抗纖維化作用，但具體調(diào)控鐵代謝的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本課題的設(shè)計(jì)完成，不僅對(duì)完善中醫(yī)學(xué)鐵代謝的理論認(rèn)知起到促進(jìn)作用，更關(guān)鍵的是對(duì)傳統(tǒng)方藥逍遙散的組方功效進(jìn)行了創(chuàng)新性的解釋?zhuān)瑸殄羞b散調(diào)節(jié)機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)提供了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中藥復(fù)方研究的快速發(fā)展提供了新的思路。