蘇毅馨,李林潞,毛 昀，褚雪鐳，陳 崢，朱世杰

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院腫瘤科，北京 100102)

食管癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，每年造成40多萬(wàn)人死亡[1]，2018年中國(guó)食管癌新發(fā)病例占全球新發(fā)病例54.1%，死亡病例占全球死亡病例56%[2]。食管鱗癌(ESCC)是主要的組織學(xué)亞型，占90%以上[3]。目前常規(guī)治療方式包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療等，但ESCC患者的5年生存率低于30%[4]。研究表明，相關(guān)基因及信號(hào)通路的改變可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移及高侵襲性，如RTK/RAS/PI3K通路中TP53、 CCND1基因突變等[5]，因此亟須進(jìn)一步探討ESCC分子機(jī)制，以期尋找ESCC早期診斷及靶向治療潛在的生物標(biāo)志物。

近年來(lái)，基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)已廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)的研究，LU等[6]分析ESCC中DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因，發(fā)現(xiàn)ABCD1、CCDC8等基因異常與患者生存預(yù)后相關(guān)。本研究通過(guò)整合公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中GSE17251、GSE45670基因芯片數(shù)據(jù)集，利用GEO2R和Venn圖在線工具獲得兩數(shù)據(jù)集中共同差異表達(dá)基因(DEGs)，其次通過(guò)DAVID在線網(wǎng)站及R語(yǔ)言進(jìn)行基因本體(GO)和基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)分析并將其可視化，然后，通過(guò)SPRING在線工具及Cytoscape軟件中MCODE(Molecular Complex Detection Technology)插件篩選出核心DEGs。最后將核心DEGs導(dǎo)入GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行表達(dá)差異及預(yù)后分析獲得與ESCC預(yù)后相關(guān)基因，并利用UALCAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證其在ESCC組織與正常組織表達(dá)差異性，探索ESCC預(yù)后的相關(guān)生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 ESCC數(shù)據(jù)收集及差異基因篩選

NCBI(National Center for Biotechnology Information)平臺(tái)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是公開(kāi)的微陣列/基因圖譜公共數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因芯片篩選。目標(biāo)芯片的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床ESCC患者標(biāo)本，排除細(xì)胞株和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；(2)入選芯片需含有ESCC組織標(biāo)本和正常組織標(biāo)本；(3)入選芯片標(biāo)準(zhǔn)為相同平臺(tái)。

確定目標(biāo)芯片后，利用在線工具GEO2R分析各個(gè)芯片數(shù)據(jù)，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|logFC|>2，P<0.05，然后利用Venn軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)進(jìn)行在線檢測(cè)，搜集DEGs。其中l(wèi)ogFC<0為下調(diào)基因，而logFC>0為上調(diào)基因。

1.2 基因功能注釋與通路富集分析

DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery Database)生物信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)整合了生物數(shù)據(jù)和分析工具，能夠?qū)蚝偷鞍踪|(zhì)進(jìn)行功能注釋。通過(guò)DAVID進(jìn)行在線分析，以人源基因?yàn)楸尘斑M(jìn)行GO和KEGG對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析及KEGG信號(hào)通路富集分析，并利用R語(yǔ)言將其可視化。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將DEGs導(dǎo)入在線STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，然后運(yùn)用Cytoscape3.6.0軟件中MCODE插件檢測(cè)核心基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)：degree cutoff=2；node score cutoff=0.2；k-core=2；max.depth=100。

1.4 核心基因驗(yàn)證與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，明確差異表達(dá)的核心基因，利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析核心基因表達(dá)差異性及預(yù)后相關(guān)性，篩選條件P<0.05；其次利用UALCAN在線工具(http://ualcan.path.uab.edu/)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出兩個(gè)符合要求的微陣列數(shù)據(jù)集，分別為GSE17251、GSE45670 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)，均來(lái)自GPL570平臺(tái)。GSE17251包含5例ESCC組織標(biāo)本和5例正常食管組織標(biāo)本，GSE45670包含28例ESCC組織標(biāo)本和10例正常食管組織標(biāo)本，共得到33例ESCC組織及15例正常組織。利用GEO2R分析從GSE17251、GSE45670芯片中分別得到差異基因161、1 087個(gè)，其中上調(diào)基因分別為81、403個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?0、684個(gè)。利用Venn軟件發(fā)現(xiàn)2個(gè)數(shù)據(jù)集共表達(dá)的差異基因有86個(gè)，其中54個(gè)為高表達(dá)基因和32個(gè)低表達(dá)基因(圖1、表1)。

A:所有差異表達(dá)基因；B：上調(diào)差異表達(dá)基因；C：下調(diào)差異表達(dá)基因。

表1 86個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào)基因及下調(diào)基因

2.2 差異表達(dá)基因GO功能注釋分析及KEGG通路富集分析

依據(jù)基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的作用，GO分析將DEGs功能注釋的結(jié)果分為3類：生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)。將差異基因進(jìn)行GO分析，篩選為P<0.05的結(jié)果(表2、圖2)。表明在生物過(guò)程中，主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、蛋白激酶活性的激活、細(xì)胞增殖的調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞分化、細(xì)胞有絲分裂、有絲分裂中期/后期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路的正向調(diào)控、磷酸化的正調(diào)控;在細(xì)胞組分中，包括紡錘體中央?yún)^(qū)、核質(zhì)、Ndc80復(fù)合物、驅(qū)動(dòng)蛋白復(fù)合物、軸突丘；在分子功能中，包括ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活性、RNA聚合酶核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合等。

表2 ESCC差異表達(dá)基因GO富集分析

續(xù)表2 ESCC差異表達(dá)基因GO富集分析

圖2 GO功能富集分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)腫瘤組織和正常ESCC組織的差異進(jìn)行進(jìn)行KEGG通路富集分析并利用R語(yǔ)言將其可視化(圖3)，結(jié)果表明：主要集中在25條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，包括ECM受體結(jié)合、蛋白質(zhì)消化、TGF-β信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、血管平滑肌收縮、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、PI3K-AKT信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化

將86個(gè)差異基因?qū)氲絊TRING網(wǎng)站構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖4)，剔除孤立節(jié)點(diǎn)后，運(yùn)用Cytoscape 3.6.0軟件中MCODE插件按照篩選核心基因，篩選到27個(gè)關(guān)鍵核心基因(圖5)。

A:CDKN3對(duì)ESCC患者OS影響；B：KIF4A對(duì)ESCC患者OS影響。

2.4 核心基因驗(yàn)證與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，明確差異表達(dá)的核心基因27個(gè)，利用GEPIA篩選出預(yù)后相關(guān)基因結(jié)果表明：CKDN3、KIF4A基因在ESCC組織中高表達(dá)(圖6)，并且高表達(dá)組的總生存期明顯短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7，經(jīng)UALCAN驗(yàn)證結(jié)果一致(圖8)。

A:CDKN3在ESCC患者高表達(dá)；B：KIF4A在ESCC患者高表達(dá)。

A:UALCAN驗(yàn)證CKDN3在ESCC患者高表達(dá)；B：UALCAN驗(yàn)證KIF4A在ESCC患者高表達(dá)。

3 討 論

食管癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有病死率高及預(yù)后差等特點(diǎn)，順鉑和5-氟尿嘧啶(5-FU) 的標(biāo)準(zhǔn)化療方案中位生存時(shí)間為201.5 d，1年生存率為27.8%[7]。近年來(lái)，伴隨測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，基因圖譜和基因芯片在科研領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了對(duì)包括ESCC在內(nèi)的腫瘤異質(zhì)性理解，并為識(shí)別新的癌癥基因和預(yù)后生物標(biāo)志物提供一個(gè)強(qiáng)有力的方法[8]。如研究表明CCND1、CTTN、EGFR、TP63和CDKN2A[9]與ESCC密切相關(guān)，ANO1可能與ESCC的預(yù)后生物標(biāo)志物[10]。但目前ESCC發(fā)病的分子機(jī)制尚未明確，迫切需要找到可用的潛在生物標(biāo)志物，生物信息學(xué)可幫助探索基因?qū)用姘l(fā)生的變化、識(shí)別潛在的生物標(biāo)志物。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出GSE17251和GSE45670兩個(gè)芯片數(shù)據(jù)集，共納入33例ESCC組織及15例正常食管組織。通過(guò)GEO2R和Venn軟件發(fā)現(xiàn)86個(gè)共有 DEG，包括54個(gè)上調(diào)DEGs和32個(gè)下調(diào)DEGs。在GO分析及KEGG分析中，主要富集在細(xì)胞增殖的調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、DNA復(fù)制、PI3K-Akt信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等方面。食管鱗狀細(xì)胞癌的演變是一個(gè)多步驟的過(guò)程，細(xì)胞損傷的累積可導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常及基因不穩(wěn)定性，細(xì)胞周期失控、細(xì)胞分化異常是惡性腫瘤的標(biāo)志，在腫瘤的致癌或進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如TP53、CDKN2A基因突變與早期食管腫瘤細(xì)胞分化相關(guān)[11]，NF750和NOTCH1的突變可影響食管鱗狀細(xì)胞的成熟導(dǎo)致癌變[12]，HERG1基因可通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13]。

通過(guò)SPRING及Cytoscape3.6.0軟件插件構(gòu)建DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)27個(gè)高表達(dá)的核心基因，經(jīng)GEPIA分析并通過(guò)UALCAN驗(yàn)證CKDN3、KIF4A在ESCC組織的高表達(dá)提示預(yù)后狀態(tài)不良。CDKN3基因?qū)儆?CDC14s家族，位于染色體位置14q22，包含21個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量23×103，是一種雙特異性磷酸酶蛋白，可對(duì)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸發(fā)揮去磷酸化作用調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，既往在多種腫瘤中報(bào)道，不同類型腫瘤組織中發(fā)揮不同作用，不僅參與細(xì)胞周期調(diào)控，對(duì)細(xì)胞凋亡及侵襲遷移能力也有影響[14]。其作為促癌基因在肺癌、宮頸癌、肝癌中CDKN3高表達(dá)提示預(yù)后不良[15]，在診斷方面，CDKN3高表達(dá)識(shí)別宮頸癌組織的靈敏度達(dá)93%，特異度達(dá)96%[16]，但在ESCC中的生物學(xué)功能尚不清楚。YU等[17]研究報(bào)道CDKN3在ESCC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)激活ESCC細(xì)胞的AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。CDKN3敲除可降低ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化，與LIU等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，其可通過(guò)AKT-p53-p21通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖侵襲。KIF4A屬于驅(qū)動(dòng)蛋白家族4(KIF4),參與紡錘體組織、染色體排列，在細(xì)胞有絲分裂、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要的作用，在乳腺癌、肺癌、肝癌[18-20]等多種腫瘤組織中高表達(dá),并可作為非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌的預(yù)后因素[18-19]，F(xiàn)OXM1通過(guò)調(diào)節(jié)KIF4A的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[20],但缺乏ESCC中的生物學(xué)功能研究。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析在不同的微陣列數(shù)據(jù)集的基礎(chǔ)上識(shí)別出ESCC組織和正常食管組織之間的兩個(gè)DEGs(CKDN3、KIF4A)在ESCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中作用，在基因?qū)用鏋閷ふ倚碌姆肿影悬c(diǎn)提供了一定的支持，也為實(shí)現(xiàn)ESCC的精準(zhǔn)治療提供了一個(gè)新思路，但還需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)正相關(guān)結(jié)果。