陳丹燕，甘 華，李 里，盧 松，王紅漫，鄧華聰，羅利偉

(1.重慶市人民醫(yī)院/中科院大學(xué)重慶醫(yī)院內(nèi)分泌科 401147；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 400016)

隨著社會經(jīng)濟水平的提高和碘鹽的普及，全球甲狀腺功能減退的發(fā)病率較前明顯降低，但妊娠期甲狀腺功能減退癥的發(fā)病率仍高[1]。0.3%～0.5%的妊娠婦女患有臨床甲狀腺功能減退，2%～5%妊娠婦女患有亞臨床甲狀腺功能減退[2-3]。在妊娠前期(12～16周)母體甲狀腺是胎兒生長發(fā)育所需的唯一甲狀腺激素來源，即使母體發(fā)生輕微的甲狀腺激素缺乏亦可導(dǎo)致后代神經(jīng)發(fā)育缺陷、神經(jīng)智力發(fā)生不可逆損傷[4-6]。因此，妊娠期甲狀腺功能減退對子代影響的研究，主要集中在神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶障礙和認(rèn)知損傷方面，而對子代腎臟影響的研究相對較少。視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，由181個氨基酸殘基組成，屬于視黃醇結(jié)合蛋白家族中分泌型視黃醇結(jié)合蛋白。RBP4由肝臟合成并釋放入血，通過與視黃醇、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白及細(xì)胞表面受體相互作用，參與代謝綜合征、動脈粥樣硬化和甲狀腺功能減退等疾病的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。然而，RBP4是否與妊娠期甲狀腺功能減退患者子代腎臟線粒體功能障礙有關(guān)，以及對可能發(fā)生機制的研究國內(nèi)外尚少見報道。本研究擬觀測RBP-4對妊娠期甲狀腺功能減退子代腎線粒體功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取SD大鼠共60只(雌雄比為2∶1，體重(200±20)g，購自重慶醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，雌鼠與雄鼠合籠交配飼養(yǎng)。交配后顯微鏡下觀察雌鼠陰道涂片，若發(fā)現(xiàn)有精子則認(rèn)為受孕成功。妊娠1周后將雌鼠隨機分為3組：亞臨床甲狀腺功能減退組(SCH組)、完全甲狀腺功能減退組(OH組)和正常對照組(CON組)進(jìn)行造模。OH組：手術(shù)完全切除甲狀腺，術(shù)后30 d眶后靜脈叢取血測促甲狀腺激素(TSH)和游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)，若TSH高于CON組、FT4<1.0 μg/dL(檢測范圍最小值)則提示造模成功；SCH組：在臨床甲狀腺功能減退大鼠模型建立成功的基礎(chǔ)上，每天持續(xù)皮下注射1.0 μg/100 g左旋甲狀腺素(L-T4，美國Sigma公司)，當(dāng)血清TSH水平高于CON組、但FT4水平在正常范圍時提示造模成功[9]；CON組：僅手術(shù)暴露甲狀腺，不切除甲狀腺。各組大鼠均于術(shù)后4～6 h喂食，為防止由于摘除甲狀旁腺誘發(fā)低鈣抽搐，術(shù)后飲水中加入1.5%葡萄糖酸鈣。將雌鼠分娩當(dāng)日定為P0天。母鼠于P1時眶后靜脈叢取血，檢測FT4、TSH，確保整個孕期造模均成功。各組仔鼠分別在出生后第14天(P14)、第35天(P35)稱體重，分別測血肌酐、血清腎素、24 h尿蛋白水平。

1.2 腎臟線粒體的制備

將腎臟組織剪碎成肉糜樣，用含有0.25 mg/mL胰酶的線粒體分離試劑懸浮碎組織塊，加入清蛋白液至終濃度10 mg/mL均勻混合，4 ℃離心機低速離心移去上清液，加入線粒體分離試劑沖洗組織碎片，Dounee勻漿器勻漿，4 ℃離心機低速離心5 min。取上清液于另一離心管內(nèi)，4 ℃離心機高速離心10 min，移去上清液，沉淀物即為線粒體，-70 ℃保存待用。

1.3 熒光定量PCR檢測RBP4 mRNA表達(dá)

用TRIzol試劑盒提取鼠腎線粒體總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，吸取2 μL RNA樣品在10 μL 體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL 進(jìn)行PCR擴增，PCR擴增體系為：5 μL 熒光定量染料2×SYBR熒光定量試劑、2 μL 引物(上下游各1 μL)、2 μL Plus反應(yīng)液、1 μL cDNA。RBP4上游引物序列為：5′-TGGTATGCCATCGCCAAA-3′，下游引物序列為：5′-TCCCAGTTGCTCAGAAGA-3′；內(nèi)參 β-actin上游引物序列為：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物序列為：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。擴增程序：95 ℃ 1 min后，進(jìn)行95 ℃ 5 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，共47個循環(huán)。得到的Ct值以2-ΔΔCt法計算mRNA表達(dá)水平。

1.4 Western blot檢測固醇調(diào)節(jié)蛋白-1c(SREBP-1c)、Netrin-1和RBP4表達(dá)

提取總蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。每孔上樣50 μg總蛋白，加等體積2×加樣緩沖液，100 ℃變性5 min，60 V電泳至樣品進(jìn)入分離膠，120 V電泳2 h，取出凝膠。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，3%脫脂奶粉稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，0.05% Tris緩沖鹽-Tween溶液室溫漂洗后與3%脫脂奶粉稀釋后的二抗37 ℃搖動孵育2 h，充分洗滌后硝基四唑氮藍(lán)(NBT/BCIP)染色試劑盒顯示蛋白印跡條帶。圖像分析(Quantity One圖像分析系統(tǒng)，BIO-RAD)檢測蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)育期各組仔鼠的腎功能指標(biāo)比較

發(fā)育期同一時間點各組間比較，同日齡的CON組與SCH組仔鼠血清腎素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與同日齡CON組仔鼠比較，OH組仔鼠血清腎素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平均增高，其中P14時兩組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但P35時兩組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。發(fā)育期不同時間點各組組內(nèi)比較，P14時仔鼠血清腎素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平均顯著低于P35時仔鼠(P<0.05)。見表1。

表1 各組仔鼠腎功指標(biāo)結(jié)果比較

2.2 各組仔鼠SREBP-1c、Netrin-1和RBP4的表達(dá)及相關(guān)分析

P14和P35時，CON組仔鼠RBP4的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于OH、SCH組仔鼠(P<0.05)。P14時SCH組仔鼠SREBP-1c和Netrin-1蛋白表達(dá)與OH組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而P35時SCH組仔鼠SREBP-1c和Netrin-1蛋白表達(dá)顯著低于OH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。OH組RBP4表達(dá)分別與SREBP -1c和Netrin-1呈正相關(guān)(P<0.05)。

圖1 各組仔鼠RBP4 mRNA表達(dá)

圖2 各組仔鼠SREBP -1c、Netrin-1和RBP4的表達(dá)

3 討 論

妊娠期甲狀腺功能減退對后代的影響是近年來妊娠內(nèi)分泌領(lǐng)域的研究熱點。已有研究表明，妊娠對母體甲狀腺功能和體積會產(chǎn)生重大影響，主要表現(xiàn)為妊娠期間人絨毛膜促性腺激素(HCG)對TSH受體的刺激作用導(dǎo)致T4和T3增加；另一方面表現(xiàn)為妊娠期間甲狀腺體積增大，且甲狀腺素和每天碘的需求量增加[10-11]。若孕前已經(jīng)診斷為完全或亞臨床型甲狀腺功能減退的患者，孕期甲狀腺激素缺乏必將更嚴(yán)重。國外有學(xué)者[12-14]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期甲狀腺功能減退患者經(jīng)使用左旋甲狀腺素替代治療后，母代的血清肌酐水平通?？苫謴?fù)正常，但對后代腎臟線粒體功能的影響目前研究尚不明確，這也是本課題組研究的重點。本研究發(fā)現(xiàn)，無論P14還是P35時，與同日齡CON組相比，SCH組仔鼠的血清腎素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而同日齡妊娠期OH組仔鼠的血清腎素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平高于CON組，其中P14時兩組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但P35時兩組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，若母代甲狀腺功能減退得不到有效控制，那么隨著病情的進(jìn)行性加重，子代可能出現(xiàn)腎臟功能損害。

甲狀腺激素在胚胎發(fā)育過程中對腎臟起著重要作用。當(dāng)機體內(nèi)甲狀腺激素水平持續(xù)降低時，細(xì)胞膜上Na+-K+泵的合成活性降低，外周血管阻力增加，靶器官或靶組織缺血，當(dāng)累及腎臟時，腎血流量減少，腎小球濾過率降低，逐漸出現(xiàn)腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害，臨床上表現(xiàn)為腎功能異常或蛋白尿，影響腎臟細(xì)胞膜的Na+/Ca2+轉(zhuǎn)運體運轉(zhuǎn)功能，誘發(fā)電解質(zhì)代謝紊亂。若腎臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，則反作用于甲狀腺組織，甲狀腺激素隨尿液排出體外，促使甲狀腺激素水平降低，誘發(fā)甲狀腺功能減退。

線粒體是代謝性轉(zhuǎn)化的重要節(jié)點，具有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。在哺乳動物中，甲狀腺激素是參與線粒體生物發(fā)生的最重要因素之一，可促進(jìn)大多數(shù)線粒體蛋白編碼基因的表達(dá)。另一方面，線粒體功能障礙可導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞損傷進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，同時加重腎臟的氧化應(yīng)激損傷[15-16]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，RBP4由肝臟合成并釋放入血，可自由經(jīng)腎小球濾過，幾乎全部被近曲小管重吸收，甲狀腺功能減退患者血清和尿中RBP4水平均增高[7-8]，這與本研究結(jié)果相一致。本研究進(jìn)一步觀測妊娠期完全和亞臨床甲狀腺功能減退組仔鼠RBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果提示，無論P14還是P35時，CON組仔鼠RBP4的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于OH、SCH組仔鼠。

WANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)，RBP-4通過抑制線粒體融合蛋白-1表達(dá)，增強線粒體分裂相關(guān)因子Drp-1、Fis1的表達(dá)，促進(jìn)線粒體功能障礙的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)線粒體功能障礙時，機體內(nèi)基因編碼的固醇調(diào)節(jié)分子蛋白-1c(SREBP-1c)的mRNA和蛋白表達(dá)水平增高，參與調(diào)節(jié)膽固醇合成和降解[18]，加重腎損傷。當(dāng)腎損傷時，應(yīng)激狀態(tài)下的近曲小管過度表達(dá)Netrin-1。Netrin-1屬于一種血管生成因子，對血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞起促進(jìn)增殖、遷移及黏附作用。Netrin-1過度表達(dá)不僅促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管新生，還可促進(jìn)動脈血管及微血管形成，加速粥樣硬化斑塊進(jìn)展[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)妊娠期甲狀腺功能減退時，子代SREBP-1c和Netrin-1的表達(dá)均明顯上調(diào)，而且OH組SREBP-1c和Netrin-1的表達(dá)水平顯著高于SCH組。進(jìn)一步分析結(jié)果提示，RBP4的表達(dá)水平分別與SREBP-1c和Netrin-1呈正相關(guān)。推測妊娠期甲狀腺功能減退時后代腎線粒體損害的可能發(fā)病機制是：RBP-4表達(dá)升高預(yù)警腎臟線粒體損害，線粒體SREBP-1c表達(dá)上調(diào)，促使Netrin-1顯著聚集在電勢降低的線粒體中自我激活，加速粥樣硬化斑塊進(jìn)展，加重腎臟固有細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，促使腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，RBP4可作為預(yù)測妊娠期甲狀腺功能減退后代早期腎損害的重要因子，RBP4/SREBP-1c/Netrin-1信號通路活化可能通過參與調(diào)節(jié)妊娠期甲狀腺功能減退仔鼠腎臟脂質(zhì)代謝和血管生成，調(diào)控腎臟線粒體功能代謝，但本研究尚缺乏臨床實驗數(shù)據(jù)佐證妊娠期甲狀腺功能減退后代腎臟線粒體損害的發(fā)病機制。