李 杰，岳靜宇，鄧博文，桑 鋒，劉 真，李 強(qiáng)，郭會(huì)軍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心，河南 鄭州 450000)

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)自從20世紀(jì)80年代開(kāi)始大流行以來(lái)，已奪走了超過(guò)3 500萬(wàn)人的生命[1]。截至2019年10月底，我國(guó)現(xiàn)存活HIV感染者約95.8萬(wàn)例，死亡15.4萬(wàn)例，有效預(yù)防與治療艾滋病、控制疾病傳播成為亟待解決的問(wèn)題[2-3]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)可有效抑制病毒核酸，但藥物存在交叉耐藥性、不良反應(yīng)大等問(wèn)題。中藥具有多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn)，在預(yù)防和治療復(fù)雜、慢性疾病方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。益艾康膠囊是國(guó)家中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目制劑，由人參、黃芪、炒白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩等中藥組成，具有益氣健脾、化濕解毒之功效。2004年至今，益艾康膠囊已累計(jì)救治4 586例人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者，取得了較好的臨床療效。研究[4-5]表明：多種免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了艾滋病發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展，并和血漿 HIV 病毒載量及外周血 CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。益艾康膠囊作為一種加強(qiáng)抗 HIV 病毒效果輔助治療艾滋病的藥物[6-7]，可能通過(guò)影響這些細(xì)胞因子從而在AIDS治療過(guò)程中起重要作用。本研究對(duì)河南部分地區(qū)HIV感染者給予益艾康膠囊聯(lián)合HAART后9種Th1/Th2細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群和病毒載量的變化及相關(guān)性進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究對(duì)象

以河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心HIV感染者血液樣品庫(kù)為依托，篩選已使用HAART預(yù)加服中藥益艾康膠囊治療患者30例，年齡18～60歲，其中男22例，女8例。符合如下條件：①HIV抗體證實(shí)陽(yáng)性的感染者；②18<年齡<60歲，能配合研究者；③簽署知情同意書(shū)，自愿受試者；④排除合并嚴(yán)重心、肝、腦、腎等原發(fā)性疾病者；⑤嚴(yán)重精神疾病者；⑥妊娠或哺乳期婦女及對(duì)中藥制劑過(guò)敏者。

2 藥 物

益艾康膠囊(由河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)20160624，0.5 g/粒)，5粒/次，3次/d，溫開(kāi)水送服。參照《中醫(yī)藥治療艾滋病臨床技術(shù)方案(試行)》[8]及《河南省中醫(yī)藥治療艾滋病常見(jiàn)病癥辨證治療要點(diǎn)》[9]，根據(jù)患者癥狀、體征、脈象、舌象等信息進(jìn)行中醫(yī)辨證論治。

3 試劑與儀器

人Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(Pro Human Cytokine Th1/Th2 Panel，9-plex)，批號(hào) 5028196，規(guī)格 96 T，伯樂(lè)(Bio-Rad)公司生產(chǎn)；人類(lèi)免疫缺陷病毒(Ⅰ型)核酸檢測(cè)試劑盒(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test，v2.0)，批號(hào) E33143，規(guī)格 48 T，羅氏(Roche)公司生產(chǎn)；絕對(duì)計(jì)數(shù)管(TruCOUNT tube)，批號(hào) 9263343，規(guī)格 50 T，BD公司生產(chǎn)；熒光單克隆抗體試劑盒(CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP/CD8-APC)，批號(hào) 61872，規(guī)格 50 T，美國(guó)BD公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞溶血素(FACS 溶血素)，批號(hào) 6204937，規(guī)格100 mL，美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

高通量細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)，型號(hào) Bio-Plex 200，Bio-Rad公司生產(chǎn)；全自動(dòng)病毒載量?jī)x，型號(hào) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan，Roche公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀，型號(hào)BD FACSCalibur，美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

4 方 法

4.1 分組與研究方法

分別于治療前、治療6個(gè)月、治療1年時(shí)，采用抗凝管(EDTAK2)采集益艾康膠囊聯(lián)合HAART患者肘靜脈血，并分離血漿，檢測(cè)細(xì)胞因子和T細(xì)胞亞群。病毒載量?jī)H檢測(cè)治療前和治療1年時(shí)。

4.2 Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)

血漿樣品用樣品稀釋液稀釋4倍，細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋系列濃度(8個(gè))，微珠、檢測(cè)抗體和PE標(biāo)記鏈霉親和素(Streptavidin-PE)分別用分析緩沖液、抗體稀釋液和分析稀釋液稀釋成1×使用液，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。檢測(cè)的細(xì)胞因子包括：白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。高通量細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)開(kāi)機(jī)后，分別使用2種校準(zhǔn)試劑(Calibration和Validation)校正儀器，將處理后的96孔板上機(jī)檢測(cè)，流式熒光法掃描檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果單位為ng/L。

4.3 HIV核糖核酸檢測(cè)

取1 mL血漿加入樣本管(S-tube)中，將樣本管置于樣本架上加載至儀器，加載試劑與耗材樣本處理單元(SPU)、K-槍頭(K-tip)和K-管(K-tube)，采用全自動(dòng)病毒載量?jī)x檢測(cè)血漿病毒載量。檢測(cè)方法為Real-time PCR定量檢測(cè)血漿中HIV核酸量，擴(kuò)增的靶區(qū)域?yàn)?HIV 結(jié)構(gòu)基因gag 區(qū)。試劑為內(nèi)標(biāo)法，設(shè)有陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品各1個(gè)。檢測(cè)范圍20～1×107copies/mL。

4.4 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

TruCOUNT tube中加入20 μL CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP/CD8-APC混合抗體，再加入50 μL全血樣品，振蕩混勻，室溫18～25 ℃,避光孵育20 min，然后加入1×FACS溶血素450 μL，混勻室溫避光孵育20 min后用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用多色分析軟件以CD45+設(shè)門(mén)，記錄CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)。

4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)9種細(xì)胞因子、CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞3次結(jié)果均數(shù)進(jìn)行比較；采用多元回歸模型分析9種細(xì)胞因子與病毒載量、T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

5 結(jié) 果

5.1 隨著治療時(shí)間增加,9種Th1/Th2細(xì)胞因子變化對(duì)比

與同組治療前對(duì)比，兩組IL-2、IL-4、IL-5等9種細(xì)胞因子在益艾康聯(lián)合HAART 6個(gè)月、1年時(shí)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 隨著治療時(shí)間增加HIV感染者外周血中9種Th1/Th2細(xì)胞因子變化對(duì)比

5.2 隨著治療時(shí)間增加,T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)比

CD3+T和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)在治療6個(gè)月和治療1年時(shí)與治療前對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)治療6個(gè)月與治療前對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但治療1年時(shí)與治療前對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 隨著治療時(shí)間增加HIV感染者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)比

5.3 多元回歸模型分析治療1年前后病毒載量與9種細(xì)胞因子2次結(jié)果均數(shù)之間的相關(guān)性對(duì)比

回歸分析結(jié)果中ANVOA(方差分析)顯示：F=2.11，P=0.048，回歸模型有相關(guān)性。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：IL-2(r=0.25，P=0.03)、IL-10(r=0.28，P=0.01)、IL-13(r=0.27，P=0.02)和TNF-α(r=0.22，P=0.04)分別與病毒載量有低度正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 多元回歸模型分析益艾康膠囊治療HIV感染者1年前后病毒載量與9種細(xì)胞因子2次結(jié)果均數(shù)之間的相關(guān)性對(duì)比 n=30

5.4 9種細(xì)胞因子與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

相關(guān)與回歸分析結(jié)果均顯示：隨著CD4+T細(xì)胞升高，TNF-α有增加趨勢(shì)，其余細(xì)胞因子有下降趨勢(shì)；CD3+T和CD8+T細(xì)胞與9種細(xì)胞因子變化趨勢(shì)一致，但無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

6 討 論

研究發(fā)現(xiàn)：多種免疫細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子參與了HIV/AIDS的發(fā)病機(jī)制，并和血漿HIV病毒載量相關(guān)[4]。CD4+T細(xì)胞起初是根據(jù)其細(xì)胞因子分泌模式來(lái)定義的。Th1應(yīng)答產(chǎn)生IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)控制細(xì)胞內(nèi)病原體；Th2應(yīng)答產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，促進(jìn)體液反應(yīng)控制細(xì)胞外病原體。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的某些功能和產(chǎn)生的細(xì)胞因子存在重疊[10-11]。在早期的HIV感染中，上述細(xì)胞因子風(fēng)暴主要由促炎性細(xì)胞因子反應(yīng)組成，與Th1反應(yīng)一致。這些細(xì)胞因子中的某些具有抗病毒活性，如IFN-γ可以增強(qiáng)先天和適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，但強(qiáng)烈的早期細(xì)胞因子反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)病毒復(fù)制和免疫病理[10]。

《醫(yī)權(quán)初編》云：“氣聚則生，氣壯則康，氣衰則弱，氣散則亡。”“氣虛”是艾滋病的基本病機(jī)，氣對(duì)機(jī)體的生理、病理，以及病情變化起著重要的作用[12]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“正氣存內(nèi)，邪不可干。”“邪之所湊，其氣必虛?！痹谶@里，“氣”指機(jī)體的免疫功能。艾滋病病因中外因?yàn)楦腥緶匦耙叨?，?nèi)因?yàn)檎龤馐軗p，精氣不足，氣血虧虛。結(jié)合辨證論治給予合適的中藥治療可以將正氣調(diào)節(jié)到正常的水平[13]。本研究觀(guān)察了患者在中藥復(fù)方益艾康膠囊聯(lián)合HAART后1年內(nèi)3次Th1/Th2細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)中西醫(yī)聯(lián)合治療半年和1年后，細(xì)胞因子水平均較治療前有所升高，9種細(xì)胞因子均在治療半年后明顯升高，治療1年后逐漸降低，體現(xiàn)了中藥治療的整體觀(guān)念，表明中藥對(duì)免疫因子的調(diào)節(jié)是雙向的。外邪入侵激活機(jī)體免疫細(xì)胞，改變細(xì)胞因子水平；但艾滋病的主要特征是持續(xù)低水平的異常免疫激活[14]，強(qiáng)烈的細(xì)胞因子風(fēng)暴也會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。因此，不同程度地矯正這些細(xì)胞水平可影響免疫應(yīng)答過(guò)程，進(jìn)而影響AIDS疾病進(jìn)展。在治療1年后，患者的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，與治療前對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步表明中西醫(yī)結(jié)合治療能夠提高CD4+T數(shù)量，有利于免疫功能重建。對(duì)這些細(xì)胞因子與病毒載量進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-10、IL-13和TNF-α與病毒載量有低度正相關(guān)性關(guān)系，表明適度降低這些細(xì)胞因子水平，可能有助于抑制病毒核酸，其具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。