王輝 宋爽 趙建傳

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第966醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科；2.內(nèi)科，遼寧 丹東 118000)

腦血管疾病致死、致殘率高，預(yù)后差，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但目前有效治療手段仍較少[1-2]，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液即銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液，是由本項(xiàng)目組研發(fā)的治療缺血性腦卒中的新型藥，具有活血通絡(luò)之功效，可有效治療腦卒中、中風(fēng)等腦血管疾病，改善患者神經(jīng)功能，但其具體作用機(jī)制有待深入探究[3-4]。早期改善缺血性腦血管疾病邊緣區(qū)血流是改善組織損傷及患者預(yù)后的關(guān)鍵，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種較強(qiáng)的促血管生成因子，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是在缺血狀態(tài)下對(duì)血管新生其核心調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator 2 related enzyme 1，SIRT1)可參與缺血缺氧狀態(tài)下氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，在缺血性腦疾病腦血管損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。腦卒中后腦神經(jīng)功能恢復(fù)還依賴于健在神經(jīng)元軸突發(fā)芽形成新的突觸聯(lián)結(jié)，即突觸可塑性[7]。因此本研究通過(guò)觀察銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液對(duì)局灶性腦缺血大鼠SIRT1/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路及突觸可塑性的影響，以期揭示其對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 成年雄性健康6周齡SPF級(jí)SD大鼠，體重180 g-200 g，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0011，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0019012509。大鼠均于(23±2)℃溫度、(50±10)% 濕度，12 h/12 h光照/黑暗環(huán)境，自由飲水飲食條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑及儀器 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液，規(guī)格：每支裝5mL，含銀杏二萜內(nèi)酯25mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20120024)購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；尼莫地平(規(guī)格：4 mg/瓶，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20060182)購(gòu)自福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司；MCAO線栓(型號(hào)：503356PK5Re)購(gòu)自天津敏學(xué)科技有限公司；兔源anti-PSD-95(貨號(hào)：ab18258)、anti-SYN(貨號(hào)：ab32127)、anti-SIRT1(貨號(hào)：ab189494)、anti-HIF-1α(貨號(hào)：ab2185)、anti-VEGF(貨號(hào)：ab53465)、anti-β-actin抗體(貨號(hào)：ab179467)，二抗羊抗兔IgG(貨號(hào)：ab6721)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；MODEL550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦缺血大鼠模型建立及分組 72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組，每組12只。模型組、尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠參照改良Zea Longa法[8]，采用10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，分離頸總動(dòng)脈，在頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎，在頸外動(dòng)脈距頸內(nèi)動(dòng)脈2 mm處剪一小口插入中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)線栓，插入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm，制備右側(cè)大腦局灶性腦缺血大鼠模型。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，不插入MCAO線栓。術(shù)后24 h尼莫地平組尾靜脈注射尼莫地平16.2 mg·kg-1，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組分別尾靜脈注射銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液1.3 mg·kg-1、2.6 mg·kg-1、5.2 mg·kg-1[9]，假手術(shù)組與模型組給予等體積0.9%生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。另術(shù)后均連續(xù)3 d腹腔注射2萬(wàn)U慶大霉素防止感染，并采用保溫?zé)粽丈浔ＷC術(shù)后大鼠肛溫37℃左右。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分測(cè)定 參照Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]，采用雙盲法于術(shù)后4 h(治療前)、7 d(治療后)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：輕提大鼠尾巴遠(yuǎn)離桌面10 cm，輕推大鼠肩膀，直至前肢滑動(dòng)數(shù)厘米，并選擇不同方向重復(fù)數(shù)次。正常大鼠2個(gè)前爪向桌面方向伸直，在不同方向抵抗力一致，而腦損傷大鼠偏癱側(cè)前肢屈曲。無(wú)神經(jīng)功能缺損記為0分；前肢屈曲，提尾實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性記為1分；側(cè)推抵抗力下降，伴前肢屈曲，無(wú)轉(zhuǎn)圈行為記為2分；伴自發(fā)性轉(zhuǎn)圈行為、自由運(yùn)動(dòng)時(shí)向偏癱側(cè)劃圈記為3分。

1.3.3 腦含水量及腦梗死率測(cè)定 治療結(jié)束后，腹腔麻醉處死大鼠，斷頭取腦，置于液氮中，沿冠狀切成 2 mm切片5片，置于1% TTC中避光孵育10 min，染色后正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈白死，拍照后采用Image J軟件分析腦梗死區(qū)域面積，梗死率=5片梗死區(qū)域總面積/5片腦片總面積×100%。斷頭取腦后稱取腦組織濕重(wet，W)，之后置于95℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱取干重(dry，D)，腦含水量=(W-D)/W×100%。

1.3.4 腦組織PSD-95、SYN、SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量檢測(cè) 采用免疫印跡(western blot，WB)法[11]檢測(cè)缺血側(cè)腦組織突觸重塑標(biāo)志蛋白突觸后密度蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)、突觸素(synaptophysin，SYN)及SIRT1/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白SIRT1、HIF-1α、VEGF表達(dá)量。采用蛋白抽提試劑盒提取腦組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0SymbolmA@g蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，添加一抗anti-PSD-95(稀釋比1∶500)、anti-SYN(稀釋比1∶20000)、anti-SIRT1(稀釋比1∶1000)、anti-HIF-1α(稀釋比1∶1000)、anti-VEGF(稀釋比1∶500)、anti-β-actin抗體(稀釋比1∶5000)4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜，二抗IgG(1∶10000)室溫孵育1.5 h，顯色，曝片，觀察并分析各蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 術(shù)后4 h，與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著增加(P<0.05)。術(shù)后7 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.05)，其中銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中、高組依次低于尼莫地平組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠腦含水量及腦梗死率比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦含水量、腦梗死率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦含水量、腦梗死率顯著降低(P<0.05)，其中銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中、高組依次低于尼莫地平組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦含水量及腦梗死率比較Table 2 Comparison of brain water content and cerebral infarction rate in each group

2.3 各組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，其中銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中、高組高于尼莫地平組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

表3 各組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量比較Table 3 Comparison of SIRT1,HIF-1α,VEGF protein expression in brain tissue of rats in each group

圖1 WB檢測(cè)腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)Figure 1 WB detection of SIRT1,HIF-1α,VEGF protein expression in brain tissue

2.4 各組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，其中銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中、高組高于尼莫地平組。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 WB檢測(cè)大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)Figure 2 Detection of PSD-95 and SYN protein expression in rat brain by WB注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.尼莫地平組；D.銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低組；E.銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中組；F.銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液高組

表4 各組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)量比較Table 4 Comparison of PSD-95 and syn protein expression in brain tissue of rats in each group

3 討論

缺血性腦卒中是由于腦血管阻塞、血流減少導(dǎo)致氧氣及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏引起腦組織應(yīng)激反應(yīng)、炎性損傷等，可導(dǎo)致神經(jīng)毒性反應(yīng)和細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙[12-13]。本研究采用MCAO線栓法[14]制備局灶性腦缺血大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4 h即可出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，提示局灶性腦缺血可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能障礙，即模型制備成功。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液是治療缺血性腦疾病的第5類新藥，主要由銀杏二萜內(nèi)酯A(約占60%)、銀杏二萜內(nèi)酯B(約占2%)、銀杏二萜內(nèi)酯K(約占26%)組成，研究表明，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可有效抑制缺血再灌注大鼠腦細(xì)胞凋亡，改善腦脊液生化水平，調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平等，對(duì)腦損傷有顯著保護(hù)作用[15-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠給予尼莫地平或銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液治療后，與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦含水量、腦梗死率顯著降低，其中銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中、高組低于尼莫地平組，提示銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可顯著減輕局灶性缺血性引起的大鼠腦組織水腫及腦梗死，改善其神經(jīng)功能。

SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的脫乙?；?，可靶向多種轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)分子，參與多種細(xì)胞增殖、凋亡、能量代謝、氧化應(yīng)激等過(guò)程的調(diào)控[18]。SIRT1還可參與血管內(nèi)皮穩(wěn)定及內(nèi)皮重塑，是血管生成反應(yīng)中重要調(diào)節(jié)因子[19]。馬毓等[20]研究報(bào)道，缺血腦組織SIRT1過(guò)表達(dá)及活性增高可減少腦梗死面積，促進(jìn)腦組織VEGF表達(dá)及神經(jīng)血管新生，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分。血管新生可增加腦梗死局部血流及氧供應(yīng)，HIF-1α可調(diào)節(jié)缺血缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧平衡，作為轉(zhuǎn)錄因子激活下游靶基因VEGF等表達(dá)，促進(jìn)新血管生成，改善腦缺血后能量代謝障礙[21]。Geng等[22]研究報(bào)道，促進(jìn)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路激活可增強(qiáng)HUVECs細(xì)胞的缺氧耐受性和血管穩(wěn)態(tài)，改善小鼠皮瓣缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量顯著降低；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量顯著增加，提示銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能及腦梗死可能與增加腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)SIRT1/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路激活有關(guān)。

局灶性腦缺血后腦組織梗死損傷，突觸后膜N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體激活，鈣離子通透性增加，可引起興奮性氨基酸毒性損傷，造成機(jī)體神經(jīng)功能障礙，而突觸結(jié)構(gòu)的可塑性與神經(jīng)生長(zhǎng)、修復(fù)等密切相關(guān)[23]。SYN是特異性位于軸突終末的突觸囊泡膜面上的鈣結(jié)合蛋白，其表達(dá)量可間接反映突觸密度，與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)。PSD-95是PSD蛋白家族之一，是附著于突觸后膜胞質(zhì)側(cè)的一種超微結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)信息傳遞的重要基礎(chǔ)，是突觸功能活動(dòng)變化的標(biāo)志性蛋白[24,25]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)量顯著降低，與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)量顯著增加，提示銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能可能與上調(diào)腦組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)，促進(jìn)突觸可塑性有關(guān)。

4 結(jié)論

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液可對(duì)抗局灶性腦缺血，改善大鼠神經(jīng)功能，可能與促進(jìn)SIRT1/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路激活及腦缺血后突觸可塑性形成有關(guān)，可對(duì)銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液治療缺血性腦疾病的作用機(jī)制研究提供新的參考。