陳霓 劉秋洪 吳丹

(1.成都市第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610031；2.四川省革命傷殘軍人醫(yī)院老年病科，四川 成都 610502)

尿毒癥是指慢性腎功能衰竭進(jìn)展至終末期出現(xiàn)的一系列綜合征，其病死率較高，且近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，極大危害患者生命健康。腎小球疾病是引起尿毒癥主要原因，約占54.2%，當(dāng)腎小球?yàn)V過率降低≤50 mL/min時(shí)，受高磷血癥、維生素D受體缺乏、低鈣血癥等因素影響，血清甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)水平明顯升高[1-2]。血清PTH過度增高不僅可導(dǎo)致腎性骨病，亦可造成紅細(xì)胞生成系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的負(fù)性影響，成為一種新型的尿毒癥毒素[3]。而腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cells，GMC)是腎小球中重要固有細(xì)胞，其過度增殖是腎臟纖維化、尿毒癥主要病因[4-5]。目前關(guān)于PTH及其對(duì)GMC體外增殖、磷脂酰肌醇-3/蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路的影響尚缺乏可靠循證支持。本研究從該角度出發(fā)，探討尿毒癥患者血清對(duì)大鼠GMC體外增殖、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響，旨在為尿毒癥防治提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2015年1月～2018年9月成都市第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科收治的72例尿毒癥患者，尿常規(guī)檢查提示尿比重固定或下降，尿蛋白陽性，有不同程度血尿和管型尿，可伴有紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞減少。生化檢查腎小球?yàn)V過率50～90 mL/min，血肌酐、血尿素氮正常為腎功能不全代償期；腎小球?yàn)V過率20～50 mL/min，血肌酐186～442μmol/L、血尿素氮>7.1 mmol/L為腎功能不全代償期；腎小球?yàn)V過率10～20 mL/min，血肌酐451～707μmol/L、血尿素17.9～28.6 mmol/L為腎功能衰竭期；腎小球?yàn)V過率<10 mL/min，血肌酐>707μmol/L、血尿素>28.6 mmol/L為腎功能衰竭終末期?；颊呔唇邮芑钚跃S生素D治療，無糖尿病及明顯感染，并簽署知情同意書，根據(jù)血清PTH水平分為正常組16例、輕中度增高組33例、重度增高組23例，本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 方法

1.2.1 主要材料、試劑與儀器 大鼠GMC細(xì)胞株；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；胎牛血清；碘化丙啶；兔抗大鼠mTOR抗體；RNA酶；二甲基亞砜；丙酮；胰蛋白酶；兔抗人Caspase-3單抗；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG；碳酸氫鈉干粉；10%山羊血清封閉液；顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(德國Partec公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國CRALZEISS)；酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)。以上材料、試劑均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2 尿毒癥患者血清標(biāo)本采集 常規(guī)消毒肘部皮膚，采集尿毒癥患者空腹靜脈血5 mL，實(shí)施離心處理，以免疫化學(xué)熒光法檢測(cè)血清PTH水平，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分為正常組16例(PTH 1～10 pmol/L)、輕中度增高組33例(PTH 11～30 pmol/L)、重度增高組23例(PTH>30 pmol/L)。

1.2.3 大鼠GMC細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠GMC細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含5%～8%胎牛血清和抗生素DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%、37℃)中，當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%融合密度時(shí)，應(yīng)用胰蛋白酶(0.25%)消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)，每周傳代1～2次，細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3～8代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 血清PTH對(duì)大鼠GMC細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期大鼠GMC細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(1×104個(gè)/孔)，200 μL/孔，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%、37℃)中，24 h細(xì)胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，促使同步靜止，棄上清，分別加入20%正常組、輕中度增高組、重度增高組血清的培養(yǎng)液，作用12 h、24 h、48 h，各時(shí)間點(diǎn)設(shè)置9個(gè)復(fù)孔。臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞>95%，干預(yù)結(jié)束前4 h加入5 g/L噻唑藍(lán)，酶標(biāo)儀設(shè)置690 nm參考波長，讀取492 nm波長光密度值，重復(fù)3次，取平均數(shù)作為最終數(shù)值。

1.2.5 血清PTH對(duì)大鼠GMC細(xì)胞周期影響 取對(duì)數(shù)生長期大鼠GMC細(xì)胞接種于6孔板(2×105個(gè)/孔)，2 mL/孔，復(fù)孔均為3個(gè)，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%、37℃)中，24 h細(xì)胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，促使同步靜止，棄上清，分別加入20%正常組、輕中度增高組、重度增高組血清作用48 h，胰蛋白酶消化處理，PBS洗，70%預(yù)冷乙醇懸浮固定細(xì)胞，吹打混勻，過夜(-20℃)，去除乙醇，實(shí)施2遍PBS洗，再用500 μL PBS重懸細(xì)胞，加入12.8 μL核糖核酸和5 μL碘化丙啶避光顯色，保存30 min以上，應(yīng)用流式細(xì)胞儀與GMCYCLE軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.6 免疫熒光法測(cè)定GMC細(xì)胞中mTOR的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期大鼠GMC細(xì)胞以2×104個(gè)/mL接種于蓋玻片24孔板(1 mL/孔)中，細(xì)胞貼壁后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，促使同步靜止，棄上清，分別加入20%正常組、輕中度增高組、重度增高組血清作用48 h，取出蓋玻片，冷丙酮固定處理，山羊血清封閉，加入1∶100兔抗大鼠mTOR抗體，過夜(4℃)，滴加FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG，反應(yīng)2 h(避光)，甘油封片，顯微鏡觀測(cè)并掃描成像。

1.2.7 免疫印跡法測(cè)定GMC細(xì)胞中Caspase-3表達(dá) GMC細(xì)胞接種于6孔板中(1×106個(gè)/mL)，2 mL/孔，PBS洗，加入細(xì)胞裂解液，冰上靜置后實(shí)施離心，每孔每次加樣10 μL，電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白值膜上，5%脫脂奶粉封閉于4℃下3 h，加入兔抗人Caspase-3單抗，過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，孵育2 h(室溫)，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行定量分析。

1.3 觀察指標(biāo) 比較3組12 h、24 h、48 h GMC細(xì)胞光密度值；3組GMC細(xì)胞周期時(shí)相分布；3組mTOR、Caspase-3表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組性別、體質(zhì)量、年齡、病程、血肌酐、血尿素氮等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組一般資料比較Table 1 Comparison of general data in three groups

2.2 GMC細(xì)胞光密度值 正常組、輕中度增高組、重度增高組12 h、24 h、48 h GMC細(xì)胞光密度值比較差異顯著(P<0.05)；重度增高組12 h、24 h、48 h GMC細(xì)胞光密度值均高于正常組、輕中度增高組，且輕中度增高組12 h、24 h、48 h GMC細(xì)胞光密度值均高于正常組(P<0.05)；3組GMC細(xì)胞光密度值在12 h、24 h、48 h隨時(shí)間推移逐漸遞增(P<0.05)，見表2。

表2 3組GMC細(xì)胞光密度值比較Table 2 Comparison of optical density in three groups of gmc cells

2.3 GMC細(xì)胞周期時(shí)相分布 正常組、輕中度增高組、重度增高組GMC細(xì)胞周期時(shí)相分布比較差異顯著(P<0.05)；與正常組相比，輕中度增高組、重度增高組GMC細(xì)胞進(jìn)入S、G2/M期明顯增多(P<0.05)；重度增高組GMC細(xì)胞進(jìn)入S、G2/M期細(xì)胞多于輕中度增高組(P<0.05)，見表3。

表3 比較3組GMC細(xì)胞周期時(shí)相分布Table 3 Phase distribution of cell cycle in three groups of GMC

2.4 mTOR、Caspase-3表達(dá)情況 正常組、輕中度增高組、重度增高組mTOR、Caspase-3表達(dá)量比較差異顯著(P<0.05)；輕中度增高組、重度增高組mTOR表達(dá)量高于正常組，Caspase-3表達(dá)量低于正常組(P<0.05)；重度增高組mTOR表達(dá)量高于輕中度增高組，Caspase-3表達(dá)量低于輕中度增高組(P<0.05)，見表4。

表4 比較3組mTOR、Caspase-3表達(dá)情況Table 4 Comparison of expression in three groups of mTOR and Caspase-3

3 討論

系膜細(xì)胞是腎臟3種固有細(xì)胞之一，是血漿大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道，具有分泌系膜基質(zhì)作用，可支持與保護(hù)腎小球毛細(xì)血管袢，且兼具平滑肌細(xì)胞功能，能調(diào)節(jié)腎小球系膜通道與濾過功能，控制腎小球毛細(xì)血管血流量[6-7]。當(dāng)GMC受到外界因素刺激時(shí)，可發(fā)生活化、增殖、收縮，形成肌成纖維細(xì)胞，造成濾過面積減少，濾過分?jǐn)?shù)降低，腎功能進(jìn)行性惡化[8-9]。目前普遍認(rèn)同炎癥、免疫、氧化等是以上事件發(fā)生的重要原因，但血清對(duì)GMC細(xì)胞增殖影響尚不明確。有研究指出，GMC細(xì)胞增殖與尿毒癥病情、預(yù)后具有一定相關(guān)性[10-11]。本研究結(jié)果顯示，正常組、輕中度增高組、重度增高組12、24、48 h GMC細(xì)胞光密度值依次呈增高趨勢(shì)(P<0.05)，提示尿毒癥患者血清能促進(jìn)GMC細(xì)胞增殖，且血清PTH水平越高，GMC細(xì)胞增殖越明顯。同時(shí)3組GMC細(xì)胞光密度值在12、24、48 h隨時(shí)間推移逐漸遞增(P<0.05)，提示GMC細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性。

正常情況下，GMC增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，以維持腎小球正常濾過功能[12-13]。而細(xì)胞生長增殖是通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，G1期細(xì)胞增多常提示細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯，S、G2/M期增多常提示細(xì)胞凋亡阻滯[14-15]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，輕中度增高組、重度增高組GMC細(xì)胞進(jìn)入S、G2/M期明顯增多，重度增高組GMC細(xì)胞進(jìn)入S、G2/M期細(xì)胞多于輕中度增高組(P<0.05)，說明尿毒癥患者GMC細(xì)胞凋亡阻滯，增殖與凋亡平衡紊亂，這是其腎功能衰竭發(fā)生的重要原因。相關(guān)報(bào)道指出，將細(xì)胞周期阻滯于G1期可抑制GMC細(xì)胞增殖，改善腎臟疾病患者病情[16-17]。此外，Caspase-3是Caspase家族成員之一，激活后可介導(dǎo)結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)蛋白的裂解，反映細(xì)胞內(nèi)凋亡機(jī)制的啟動(dòng)，在細(xì)胞凋亡中具有不可替代作用[18-21]。本研究在以上研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，正常組、輕中度增高組、重度增高組Caspase-3表達(dá)量依次降低(P<0.05)，與以上研究相符，提示尿毒癥患者血清PTH越高，細(xì)胞凋亡越少，這符合GMC細(xì)胞過度增殖狀態(tài)。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是機(jī)體經(jīng)典信號(hào)通路之一。有學(xué)者研究指出[23-24]，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。PI3K磷酸化磷脂酰肌醇(PI)的肌醇環(huán)上有5個(gè)可被磷酸化位點(diǎn)，其中PI-3-磷酸能刺激細(xì)胞遷移，PI-3，4-二磷酸可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抵抗細(xì)胞凋亡，PI-3，4，5-三磷酸能調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生長、存活，因此PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與GMC細(xì)胞增殖有關(guān)[25-28]。鐘利平等[31]指出，腎纖維化模型小鼠PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路表達(dá)量較高。張春江等[30]研究指出，下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可抑制大鼠GMC細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，正常組、輕中度增高組、重度增高組mTOR表達(dá)量依次升高(P<0.05)，說明尿毒癥患者血清PTH可調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，這可影響GMC細(xì)胞增殖情況，故推測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制劑可抑制GMC細(xì)胞增殖，有利于緩解患者病情，但詳情及可靠性有待大樣本量的深入研究。慢性腎臟病患者通常在3期逐漸出現(xiàn)PTH升高，本研究不足之處在于，納入患者中較多PTH完全正常的患者，可能造成納入樣本的偏倚，有待后續(xù)的進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

尿毒癥患者血清可導(dǎo)致GMC增殖，且甲狀旁腺功能亢進(jìn)可促進(jìn)GMC增殖，提高PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑可能有助于抑制GMC增殖，延緩尿毒癥患者腎功能衰竭進(jìn)程，有望為早期預(yù)防腎功能衰竭提供一個(gè)新靶點(diǎn)。