程亮亮 田毅 譚義文 王丹

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院麻醉科,海南 ?？?570208)

術后神經(jīng)認知功能障礙(Post-operative neurocognitive dysfunction，PNCD)是老年麻醉手術后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，具有記憶受損、認知功能異常等表現(xiàn)，影響疾病恢復進程，甚至會發(fā)展為老年癡呆，嚴重影響患者的生活質量[1]。目前，臨床尚無有效防治PNCD的手段，部分藥物通過減輕全身炎癥或營養(yǎng)神經(jīng)治療效，但果仍不理想[2-3]。臨床研究表明，臨床常用吸入麻醉藥物，如七氟醚、氟烷等，具有誘導迅速、無明顯蓄積、蘇醒快等優(yōu)點，但高濃度藥物仍會對中樞神經(jīng)功能造成損傷，尤其是老齡人群廣泛存在腦組織功能退化，麻醉術后PNCD發(fā)生風險較高[4-5]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，七氟醚吸入麻醉可能通過激活海馬神經(jīng)元自噬引起海馬神經(jīng)元損傷，具有一定神經(jīng)毒性作用。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)屬于高選擇性α2腎上腺素能受體(α2 adrenergic receptor，α2-AR)激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，常于老年患者麻醉誘導前用藥，以穩(wěn)定誘導過程中血流動力學，輔助全身麻醉[8-9]。近年來，有報道認為DEX可預防老年非心臟手術患者術后PNCD發(fā)生風險，但具體影響機制尚不明確[10]。鑒于此，本研究在七氟醚麻醉下采用肝葉部分切除術建立PNCD大鼠模型，模擬腹腔術后神經(jīng)功能損傷，觀察不同劑量DEX通過自噬信號通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)對老年PNCD大鼠神經(jīng)功能的影響，為DEX臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20090248，規(guī)格2 mL:200 μg，批號：10081435)，七氟醚(湖北廣奧生物科技有限公司，批號：6120104)，逆轉錄試劑盒(日本Takara公司，批號：D31145791)，兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)單抗(批號：ab11362)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)單抗(批號：ab12054)、磷酸化Akt(phosphorylation of Akt，p-Akt)多抗(批號：ab37159)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)單抗(批號：ab60218)、自噬標記蛋白Beclin-1(批號：ab55140)、微管相關蛋白輕鏈3(light chain 3，LC3，批號：ab12194)(一抗，美國Abcam公司)，山羊抗兔PI3K(批號：ab13446)、Akt(批號：ab20137)、p-Akt(批號：)、mTOR(批號：ab32194)、Beclin-1(批號：ab01510)、LC3(批號：ab00120)(二抗，美國Abcam公司)。

1.2 主要儀器 CM-120型透射電鏡(荷蘭PHILIPS公司)，Morris水迷宮及其配套圖像采集分析系統(tǒng)(北京微信斯達科技發(fā)展有限責任公司)，3550UV酶標儀、7000實時熒光定量PCR儀、電泳儀、CheniDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.3 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只，18月齡，體質量(600±100)g，購自南京大學模式動物研究所，許可證號：SCXK(蘇)2018-0001，飼養(yǎng)條件：室溫(24±1)℃，60%濕度，12 h/12 h晝夜節(jié)律照明，2只/籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及干預 采用隨機數(shù)表法將50只SD大鼠分為5組：對照組、模型組、DEX低、中、高劑量組5組。模型組吸入3%七氟醚麻醉；DEX低、中、高劑量組分別預先腹腔注射25、50、100 μg/kg右美托咪定(按照人與動物體表面積換算法換算臨床等效劑量為6.3 μg/kg，DEX低、中、高劑量分別約為4倍、8倍、16倍臨床等效劑量)，30 min后3組均吸入3%七氟醚麻醉。各組大鼠麻醉后，參照文獻[11]均進行部分肝葉切除術，建立PNCD大鼠模型，Morris水迷宮試驗檢測結果與對照組相比差異顯著，即為建模成功。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg，持續(xù)麻醉2 h(手術均結束)。

1.4.2 修正神經(jīng)功能缺損程度(neurological severity score，NSS)評估 術后1、3、7 d采用NSS評分量表[12]對各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度進行評估，包括提尾、行走、感覺、平衡、反射5個試驗內容，每個試驗評分3、3、2、6、4分，總分18分，分數(shù)越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.4.3 認知功能評估 采用Morris水迷宮試驗[13]對各組大鼠認知功能進行評估：水迷宮直徑1.5 m、水深0.75 m、控制水溫(25±1)℃，將水池分為4個象限，安全島置于第I象限，水下1 cm，宮體正上方攝像頭可記錄運動軌跡，固定4各入水點和固定實驗時間。術后第7 d開始進行適應性訓練1次，實驗分兩部分：①術后第8～11 d定位巡航試驗，隨機選取某1象限入水點，大鼠面對宮壁輕放入池，開始計時，記錄60 s內找到并登陸安全島的時間，即逃避潛伏期；若60 s內未找到安全島，由實驗者引導大鼠至安全島，并停留30 s，逃避潛伏期記錄為60 s。每個象限入水1次/d，共入水4次/d，每次間隔2 h。②術后第12 d進行空間探索試驗，撤去安全島，隨機選擇入水點，記錄60 s內的游泳軌跡，統(tǒng)計目標象限游泳距離占比，即大鼠在目標象限(第I象限)內的游泳距離/總游泳距離×100%。

1.4.4 海馬神經(jīng)元超微結構觀察 水迷宮試驗結束后，立即處死各組大鼠，冰凍手術臺迅速取出腦組織，取左側海馬組織，修整為邊長為1 cm的組織塊，放置于4%戊二醛中固定4 h，然后放置1%鋨酸固定30 min，脫水后樹脂包埋，制作厚度為50 nm切片，進一步醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察、拍照，計數(shù)自噬小體數(shù)目。

1.4.5 海馬PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA檢測 水迷宮試驗結束后，處死大鼠后取部分右側海馬組織，剪碎后提取組織中取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)含量，逆轉錄法獲得互補鏈脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，經(jīng)鑒定后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反應體系：Taq酶 11.5 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL；反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重復35個循環(huán)。以β-actin為管家基因，2-△△CT為目的基因的相對表達強度，重復3次取Ct平均值。引物序列，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.6 海馬PI3K、pAkt、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3-II、LC3-I蛋白檢測 水迷宮試驗結束后，處死大鼠后取部分右側海馬組織，加入液氮研磨，加入細胞裂解液，沸水浴8～10 min，12000 r/min離心15 min，取上清液，蛋白定量后，取40 μg樣品于上樣緩沖液混勻，沸水浴3 min，再次離心收集上清液，然后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉儀轉膜60 min，加入封閉液搖床2 h(室溫)，洗滌后加入一抗(1∶1000)，搖床孵育過夜(4℃)，洗滌后二抗(1∶8000)，孵育60 min(常溫)，暗室中曝光，并于凝膠成像系統(tǒng)中掃描，進行灰度值分析，以目的蛋白與內參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損程度對比 術后50只大鼠均存活。DEX各劑量組NSS評分術后3 d、7 d均低于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍高于對照組(P<0.05)；DEX各劑量組術后NSS評分均隨時間的延長而降低(P<0.05)，模型組術后7 d較術后3 d稍有降低，但較術后1 d仍較高(P<0.05)，而對照組無明顯變化，見表2。

表2 NSS評分對比Table 2 Comparison of NSS scores

2.2 逃避潛伏期、目標象限游泳距離占比對比 DEX各劑量組術后9～11 d逃避潛伏期均短于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍長于較對照組(P<0.05)；對照組、3劑量組逃避潛伏期隨時間而縮短(P<0.05)，而模型組無明顯變化。DEX各劑量組目標象限游泳距離占比均高于模型組，其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組，但仍低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 逃避潛伏期、目標象限游泳距離占比對比Table 3 Comparison of escape latency and target quadrant swimming distance

2.3 海馬神經(jīng)元超微結構觀察 透射電鏡觀察結果顯示，對照組未觀察到自噬小體，模型組自噬小體廣泛存在(8.20±0.94)個/視野，形態(tài)多樣化，可見雙層膜包裹的顆粒狀細胞質或退化細胞器。DEX各劑量組自噬小體數(shù)量減少，DEX低、中、高劑量組分別為(5.58±0.50)個/視野、(4.22±0.37)個/視野、(2.07±0.24)個/視野；DEX各劑量組自噬小體數(shù)目均少于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍多于對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 透射電鏡下海馬神經(jīng)元超微結構圖片(×12 K)Figure 1 Ultrastructural picture of hippocampal neurons under transmission electron microscopy注：Ly.溶酶體；M.線粒體；N.細胞核；紅色箭頭為自噬小體

2.4 海馬PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA表達對比 DEX各劑量組PI3K、mTOR mRNA相對表達量均高于模型組，其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組，但仍低于對照組(P<0.05)；DEX各劑量組Beclin-1、LC3 mRNA相對表達量均低于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍高于對照組(P<0.05)，Akt mRNA相對表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA相對表達量對比Figure 2 Comparison of relative expressions of PI3K,Akt,mTOR,Beclin-1 and LC3 mRNA

2.5 海馬PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表達及pAkt/Akt、LC3-II/LC3-I對比 DEX各劑量組PI3K、mTOR蛋白相對表達量、pAkt/Akt均高于模型組，其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組，但仍低于對照組(P<0.05)；DEX各劑量組Beclin-1蛋白相對表達量、LC3-II/LC3-I均低于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍高于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 海馬PI3K、Akt、pAkt、mTOR、Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表達(n=4，F(xiàn)igure 3 Expressions of PI3K,Akt,pAkt,mTOR,Beclin-1,LC3-I and LC3-II in hippocampus 注：與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與DEX低劑量組比，③P<0.05；DEX中劑量組比，④P<0.05注：與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與DEX低劑量組比，③P<0.05；DEX中劑量組比，④P<0.05

3 討論

中樞神經(jīng)功能損害屬于麻醉手術后常見并發(fā)癥，臨床多表現(xiàn)為記憶、學習、認知功能異常等，可能持續(xù)數(shù)月甚至更長時間[14-15]。動物實驗表明[16-17]，麻醉及手術應激可引起PNCD，其多能自行恢復，但對神經(jīng)系統(tǒng)仍會造成一定損傷。PNCD發(fā)生機制復雜，涉及多種蛋白質表達及信號通路調控作用，最終可引起海馬神經(jīng)元細胞死亡。DEX屬于美托嘧啶的異構體，其作用機制為通過激動腦脊髓中α2-AR而發(fā)揮鎮(zhèn)靜、止痛和抗交感作用，且已有研究證實DEX對多種腦損傷具有神經(jīng)保護作用[18-20]。

水迷宮定位巡航和空間探索實驗可評估大鼠的學習、記憶功能。尋找休息場所是動物本能，該過程可反應出大鼠對復雜信息的采集、整合和學習能力，尋找目標象限完成度與海馬區(qū)結構和功能、中樞神經(jīng)功能損害等關系密切[21]。本研究采用麻醉下行部分肝葉切除術法制備PNCD大鼠模型，模擬臨床剖腹手術對機體神經(jīng)功能的影響，術后采用水迷宮實驗檢測發(fā)現(xiàn)，逃避潛伏期長于對照組，目標象限游泳距離占比短于對照組，提示麻醉下行部分肝葉切除術法制備PNCD成功。DEX可有效抑制交感神經(jīng)興奮，激活突觸前膜α2-AR(α1∶α2=1∶1600)[22]，繼而負反饋抑制突觸后膜興奮，降低交感神經(jīng)興奮性。魏曉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，麻醉前應用DEX有助于維持圍術期血流動力學穩(wěn)定，降低PNCD發(fā)生率，與本研究結果相似。本研究對PNCD大鼠術前應用不同劑量DEX干預，術后NSS評分低于模型組，逃避潛伏期均短于模型組，但仍長于對照組，目標象限游泳距離占比均高于模型組，但仍低于對照組，且均具有劑量依賴性，由此可知，DEX對減輕老年大鼠PNCD神經(jīng)功能損傷有積極意義。

動物實驗發(fā)現(xiàn)，老年大鼠術后海馬部位常出現(xiàn)萎縮、體積減小現(xiàn)象[24]，進一步研究顯示可能與海馬神經(jīng)元死亡有關。自噬是海馬神經(jīng)元主要死亡形式，本研究中透射電鏡顯示模型組自噬小體廣泛存在，七氟醚麻醉下行肝葉切除術后大鼠海馬神經(jīng)元確有損傷。自噬屬于Ⅱ型程序性細胞死亡，Beclin-1、LC3均屬于自噬調控蛋白，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大、Beclin-1表達增加均與自噬體形成正相關[25]。PI3K屬于異源二聚體，Akt是其下游效應因子，當信號傳導至細胞表面后，PI3K激活，Akt膜轉位磷酸化激活，細胞內磷酸化的Akt通過活化下游靶基因發(fā)揮效應[26-27]。mTOR屬于細胞分裂及合成的調控中心，多種信號均可通過I型PI3K/Akt傳遞至mTOR啟動靶點復合體1(TORC1)，達到激活閾值后阻滯細胞分裂信號傳遞[28-29]。王建偉等[30]研究顯示，DEX可通過上調mTOR蛋白、下調LC3-II蛋白表達減輕大鼠立體肺缺血再灌注損傷引起的自噬，與本研究結果相似。本研究中模型組PI3K、mTOR mRNA和蛋白相對表達量、pAkt/Akt均低于對照組，Beclin-1 mRNA和蛋白、LC3 mRNA相對表達量、LC3-II/LC3-I高于對照組，提示PNCD大鼠海馬組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路處于抑制狀態(tài)，自噬相關基因和蛋白異常高表達。進一步應用不同劑量DEX干預后，PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，自噬相關基因和蛋白表達被抑制，提示PNCD大鼠存在PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制，使老年大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)結構改變，但DEX可逆轉該信號通路的抑制作用，從而減輕海馬神經(jīng)元自噬，改善神經(jīng)功能損傷。

4 結論

本研究結果顯示，DEX可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路減輕七氟醚麻醉下肝葉切除術老年大鼠神經(jīng)功能損傷，并抑制海馬神經(jīng)元自噬，可為臨床中應用DEX預防老年人群麻醉術后神經(jīng)功能損傷提供理論支持，但其是否存在其他調控通路發(fā)揮作用仍需要進一步探討。