丁徐 趙毅 黃濤 宋登新

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院骨科，上海 200940)

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病，與年齡、性別、種族等因素密切相關(guān)，骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果[1-4]。雞血藤來(lái)源于豆科植物密花豆的干燥藤莖，具有促進(jìn)骨折愈合、抗關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)血管生成等作用[5-8]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，近年研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨折的愈合密切相關(guān)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)骨折的愈合，使成骨細(xì)胞的數(shù)量增加，促進(jìn)新骨的生成[9-13]。本文通過(guò)研究雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后恢復(fù)的作用及對(duì)大鼠體內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，為骨質(zhì)疏松性骨折的治療提供新的參考和依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雌性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(瀘)2017-0001]，動(dòng)物房溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑 雞血藤提取物(10∶1)購(gòu)自武漢市恒沃科技有限公司；雙能 X 線骨密度測(cè)量?jī)x購(gòu)自美國(guó)GE公司；IN STRON 3367電子拉伸試驗(yàn)機(jī)購(gòu)自英國(guó)英斯特朗公司；雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液、ECL顯色液購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立 將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、雞血藤低劑量組、雞血藤中劑量組及雞血藤高劑量組5組，每組12只。除對(duì)照組外，其余大鼠采用大鼠卵巢摘除法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型[14]，具體方法為：腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，采用背側(cè)入路，常規(guī)備皮、消毒后，取后方髂骨嵴上2cm，脊柱旁1cm處做長(zhǎng)約2cm縱行切口，依次切開(kāi)皮膚，皮下和肌層，暴露腹腔，沿輸卵管尋找到卵巢組織后，嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管并切除卵巢，逐層間斷縫合，術(shù)后肌肉注射給予每只大鼠80萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染，對(duì)照組不做處理，然后所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)8周，期間大鼠自由飲食。造模結(jié)束后應(yīng)用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x，檢測(cè)所有大鼠骨密度，以評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松大鼠模型建立是否成功。

1.3.2 骨折大鼠模型的建立及給藥 骨質(zhì)疏松大鼠建模成功后，參照文獻(xiàn)方法[15]，除對(duì)照組外，其余所有大鼠行右大腿中段外側(cè)縱向皮膚切口，長(zhǎng)約3cm，暴露股骨干，在股骨干中段用線鋸鋸斷成橫行骨折，用電鉆以直徑1.0mm克氏針從骨折端鉆入遠(yuǎn)端，穿出股骨髁，復(fù)位骨折，從近折端打入克氏針，截?cái)喽嘤嗫耸厢?，逐層間斷縫合,術(shù)中注意保護(hù)坐骨神經(jīng)和肌肉組織，術(shù)后肌肉注射給予每只大鼠80萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染，對(duì)照組不做處理。術(shù)后第二天開(kāi)始，雞血藤低、中、高劑量組根據(jù)大鼠體重分別按照50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg灌胃給予大鼠雞血藤提取物，對(duì)照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，所有組別每天給藥1次，連續(xù)給藥8周，最后一次給藥24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 大鼠骨密度的測(cè)定 給藥結(jié)束后，以大鼠右側(cè)股骨骨折端2.0mm×2.0mm 為中心區(qū)域，使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通過(guò)雙能X射線吸收測(cè)定法(DEXA)在Hi-res、small animal模式下測(cè)量骨痂骨密度。

1.3.4 大鼠股骨生物力學(xué)測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[16]，所有大鼠禁食12h后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后腹主動(dòng)脈取血處死，取大鼠右側(cè)股骨標(biāo)本，去除克氏針后，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，加載速度為2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，然后讀出最大載荷和抗彎強(qiáng)度。

1.3.5 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 大鼠處死后，將右側(cè)股骨骨折端放入4%中性甲醛中固定48h，脫鈣液脫鈣處理，每周更換一次脫鈣液，共脫鈣5周，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，于正中矢狀面進(jìn)行4μm連續(xù)切片。然后進(jìn)行常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min。②復(fù)水：依次置于100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各兩次,然后把水吸干。③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來(lái)水流水沖洗，2 min，把水吸干。④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，吸干水。⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min。⑥脫水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min。⑦封片：置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹(shù)膠封片。

1.3.6 Western blot檢測(cè)大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平 將大鼠右側(cè)股骨骨折端骨組織在液氮中迅速研磨成粉末，取約200 g粉末加入1mL含PMSF的組織裂解液于冰上靜置2 h，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，處理好待測(cè)樣品后，取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1h，經(jīng)LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗體(1∶1000)孵育后，4℃過(guò)夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 骨折前各組大鼠全身骨密度 與對(duì)照組相比，模型組及雞血藤低、中、高劑量組大鼠全身骨密度均顯著降低(P<0.05)，且模型組及雞血藤低、中、高劑量組間大鼠骨密度不存在顯著性差異(P>0.05)，提示骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 骨折前各組大鼠全身骨密度Table 1 Whole body bone mineral density of rats in different groups before fracture

2.2 雞血藤對(duì)骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨密度的影響 與對(duì)照組相比，模型組骨質(zhì)疏松性骨折大鼠股骨骨折端骨密度顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，雞血藤低、中、高劑量組大鼠股骨骨折端骨密度顯著升高(P<0.05)，且隨著雞血藤劑量的增加，骨折大鼠股骨骨密度逐漸升高，提示雞血藤能夠呈劑量依賴性顯著增加骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后的骨密度，促進(jìn)受損骨組織恢復(fù)，改善術(shù)后骨組織生理結(jié)構(gòu)及功能，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度Table 2 Bone mineral density of femur in different groups of rats

2.3 雞血藤對(duì)骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨生物力學(xué)的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度均顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，雞血藤低、中、高劑量組大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度均顯著升高(P<0.05)，且隨著雞血藤劑量的增加，大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度逐漸升高，提示雞血藤能夠呈劑量依賴性顯著改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后的生物力學(xué)指標(biāo)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨組織生理結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)，加速新骨的形成，增強(qiáng)骨組織硬度，從而降低大鼠再次骨折風(fēng)險(xiǎn)，改善大鼠的疾病狀態(tài)及轉(zhuǎn)歸，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度Table 3 Maximum load and bending strength of rats in different groups

2.4 組織病理學(xué)檢查 與對(duì)照組相比，模型組大鼠骨痂骨小梁明顯減少，散在分布，排列不整齊，成骨細(xì)胞明顯減少，與模型組相比，雞血藤各劑量組大鼠骨痂骨小梁明顯增多，成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且雞血藤低、中劑量組大鼠骨小梁粗細(xì)均勻，排列緊密，部分連成網(wǎng)狀，可見(jiàn)新生微小血管，雞血藤高劑量組大鼠骨小梁增粗明顯，生長(zhǎng)旺盛，排列致密整齊，可見(jiàn)大量成骨細(xì)胞及新生血管，提示雞血藤能夠顯著改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨痂的形成，促進(jìn)骨組織的恢復(fù)及愈合，加快骨折大鼠新骨的形成，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE100×)Figure 1 Histopathological examination of rats in different groups注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.雞血藤低劑量組；D.雞血藤中劑量組；E.雞血藤高劑量組

2.5 雞血藤對(duì)骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后股骨Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 各組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平均顯著降低(P<0.05)，提示骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織的恢復(fù)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)；與模型組相比，雞血藤各劑量組大鼠骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平均顯著升高(P<0.05)，且LRP5、β-catenin、Runx2水平與雞血藤劑量表現(xiàn)出依賴性，提示雞血藤能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)骨折大鼠骨組織修復(fù)。

圖2 各組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平Figure 2 Protein levels of LRP5,β-catenin and Runx2 in femoral fracture tissues of rats in different groups注：與對(duì)照組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病，其病理特征為骨量降低、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加，骨強(qiáng)度下降，易發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與年齡、性別、種族等因素密切相關(guān)，其中絕經(jīng)后婦女發(fā)生率較高[1-3]。骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后遺癥，目前臨床上對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折的治療基本原則是復(fù)位、固定、功能鍛煉和抗骨質(zhì)疏松[4]。

雞血藤來(lái)源于豆科植物密花豆的干燥藤莖，中國(guó)古典醫(yī)學(xué)著作記載雞血藤具有活血補(bǔ)血，調(diào)經(jīng)止痛，舒筋活絡(luò)等作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤具有促進(jìn)骨折愈合、抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、改善心肌缺血、促進(jìn)血管生成、改善小鼠脾臟輻射損傷等藥理作用[5-8]。雞血藤用于治療骨質(zhì)疏松等相關(guān)疾病的中藥成方制劑廣泛記載于中醫(yī)古典醫(yī)學(xué)著作中，近年仲超[17]、宋松[18]等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)含有雞血藤的中藥方劑在骨質(zhì)疏松的臨床治療中療效顯著。但雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)后恢復(fù)的作用及機(jī)制目前尚罕見(jiàn)明確報(bào)道。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在發(fā)育過(guò)程許多不同的細(xì)胞和組織中，Wnt/β-catenin整合許多其他通路所傳遞的信號(hào)，并通過(guò)多種細(xì)胞因子引起一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，β-catenin既是一個(gè)完整的細(xì)胞-細(xì)胞粘附接頭蛋白也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔因子，存在于多種條件依賴的活化和抑制復(fù)合體中，與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和增殖密切相關(guān)，同時(shí)也與多種疾病密切相關(guān)[9-10]。研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨折的愈合密切相關(guān)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)骨折的愈合，使成骨細(xì)胞的數(shù)量增加，促進(jìn)新骨的生成[11-13]。石曉征等[19]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平顯著降低，梅花鹿茸Ⅰ型膠原能夠顯著改善大鼠骨密度，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。趙素霞等[20]研究發(fā)現(xiàn)去卵巢引起的大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)狀態(tài)能夠顯著改善大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。史巖等[21]也發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠疾病恢復(fù)過(guò)程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路扮演著重要角色，調(diào)節(jié)大鼠該通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，能夠促進(jìn)骨折大鼠的傷口愈合。由此可見(jiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松及發(fā)病機(jī)制及疾病恢復(fù)過(guò)程中都至關(guān)重要，調(diào)節(jié)該信號(hào)通路的表達(dá)可能是骨質(zhì)疏松治療過(guò)程中的關(guān)鍵。

本文研究結(jié)果表明：與模型組相比，雞血藤各劑量組大鼠股骨骨折端骨密度、最大載荷和抗彎強(qiáng)度均顯著升高，骨密度是反應(yīng)骨量的常用指標(biāo)，骨生物力學(xué)中最大載荷及抗彎強(qiáng)度能夠直接反應(yīng)骨質(zhì)疏松骨骼的骨折風(fēng)險(xiǎn)及骨生理結(jié)構(gòu)及功能，這表明雞血藤能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨組織的生理結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，促進(jìn)新骨形成，加速骨折的愈合，降低大鼠再次發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)，改善大鼠的疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。組織病理學(xué)變化明顯改善，雞血藤各劑量組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平均顯著升高，提示雞血藤能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)骨折大鼠骨組織修復(fù)。由于時(shí)間及資金限制，本文未能就雞血藤對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路上下游相關(guān)的其他蛋白進(jìn)行考察，擬在今后的研究中對(duì)雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠發(fā)病機(jī)制相關(guān)的其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其靶向調(diào)節(jié)作用進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)論

雞血藤能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)后骨密度、骨生物力學(xué)等的恢復(fù)，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。