王一，李春秋，欒廣宇，郭東華，張旭，原冬偉，孫東波

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶163319）

整合素是一種成員較多的免疫受體蛋白，整合素（integrin）最早是在1987年研究發(fā)現的，其主要由α與β兩種亞基組成。目前發(fā)現有18種α亞基及8種β亞基，兩種亞基通過不同的組合方法形成了24種不同的整合素分子[1]。整合素是一種廣泛分布在細胞表面的膜狀蛋白，可在細胞表面作為重要的黏附受體[2]。根據配體結合特異性與亞基組成分類，整合素最大的三個分組為α亞基、β1亞基和β2亞基。整合素的受體包括精氨酶-甘氨酶-天冬氨酶（RGD）、層粘連蛋白、白細胞、膠原蛋白[3]。α和β亞基彼此不具有同源性，結構有較大的差異。從細胞外結構來看，雖然兩種亞基的胞外區(qū)都比較長，大約含有700至1 100種氨基酸而胞內區(qū)則相對較短，至含有40至70種氨基酸。但是我們也發(fā)現，和β亞基相比，α亞基的胞內區(qū)的長度較短，所以，二者的細胞外結構差異性較大。但是β4屬于一個例外，其胞內區(qū)較長[4]。

整合素的胞外區(qū)和細胞外基質相連，胞內區(qū)和細胞骨架相連。所以，整合素起到連接細胞和外界環(huán)境的功能，使得細胞具備黏附的能力[5]。整合素可以作為雙向性的信號轉導媒介，它可以介導ECM信號從細胞外向細胞內傳遞，調控細胞的活性、代謝、黏附、遷移等。此由外向內傳遞信息由整合素與胞質蛋白結合介導[6]。它也可以介導胞質蛋白信號從細胞內向細胞外傳遞，調控細胞分化、存活、增殖等，其中整合素β亞基在信號傳導過程中發(fā)揮重要的作用。此由內向外傳遞信號由胞內的刺激因子介導[7-8]。整合素與黏附分子及信使分子相互作用而實現整合素的雙向信號轉導。整合素的亞基具有不同的功能，整合素β1是一種可以實現細胞與細胞外基質連接的作用，使得細胞能夠產生黏附作用；而整合素β2主要作用于各個細胞之間，其主要在白細胞表面表達；整合素β3參與血小板聚集，在血栓形成中發(fā)揮作用[9]。

機體在感染病毒之后，細胞表面的受體最先和病毒接觸，從現有的研究結果來看，細胞表面的糖蛋白是最主要的受體物質，也就是病毒最先與之結合的位置，而整合素正是一種存在于細胞表面的糖蛋白物質[10]。研究發(fā)現整合素可以在多種病毒感染過程中發(fā)揮作用，整合素可以作為目前已知的多種病毒受體或共受體，例如人類皰疹病毒、艾博拉病毒、免疫缺陷病毒、腺病毒、口蹄疫病毒、輪狀病毒等[11-16]，促進病毒感染宿主細胞，因此使其在病毒學研究領域引起了廣泛關注。整合素β1及其自身和α亞基結合的異二聚體，都可以作為多種病毒的感染受體或感染相關蛋白參與病毒的侵入過程。例如，β1亞基和αv亞基形成的整合素αvβ1在禽偏肺病毒的感染過程中起著重要作用，促進病毒與細胞的結合[17]；在狂犬病病毒感染者的機體內，科學家發(fā)現整合素β1發(fā)揮了重要作用，促進了狂犬病病毒與細胞的結合，增加了感染的幾率[18]。高水平表達的整合素β1促進愛波斯坦—巴爾病毒的感染[19]。整合素β1通過激活PI3K/Akt信號傳導促進牛痘病毒進入細胞[20]。大腦中高效表達的整合素β1能夠促進巨細胞病毒感染[21]。

目前，有關豬整合素β1作為與病毒感染受體或相關蛋白的報道鮮為人知，研究通過對豬整合素β1進行序列優(yōu)化后利用大腸桿菌對其進行表達，從而制備出多克隆抗體，并對制備出的抗體進行分析實驗。為進一步研究豬整合素β1在豬病毒感染過程中的作用和機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及實驗動物

實驗用兔購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自Sigma-Aldrich公司，IPTG、HRP標記羊抗兔IgG及HRP標記羊抗鼠IgG購自Biosharp公司，Xh oI限制性內切酶及Bam HI限制性內切酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，TMB單組分顯色液、質粒小量提取試劑盒及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自北京索萊寶生物技術有限公司，PEG8 000試劑盒購自德國BioFrox公司。

1.2 豬整合素β1基因的合成

通過CBS在線網站使用TMHMM-2.0工具分析豬整合素β1基因序列（GenBank NM_213968.1）的跨膜區(qū)、胞外區(qū)、胞內區(qū)。選擇親水的胞外區(qū)序列，用DNAStar軟件的Protean工具預測抗原區(qū)，根據大腸桿菌的偏愛密碼子對抗原性良好區(qū)域進行優(yōu)化，在5'與3'末端加入Bam HI與Xho I酶切位點，豬整合素β1基因的核苷酸序列人工合成后與pGEX-6p-1載體連接，實驗中所使用的質粒pGEX-6p-1-β1是上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 豬整合素β1基因的原核表達及純化

首先，將合成的質粒pGEX-6p-1-β1轉化到大腸桿菌的感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）中，然后從中選擇一個單一的菌落，將其放入具有氨芐抗性的LB溶液中，將溶液置于37℃的環(huán)境中進行細菌培養(yǎng)。當檢測到該培養(yǎng)液的OD600值為0.6時，則向其中加入0.6 mmol·L-1的IPTG。然后將溶液置于160 r·min-1的環(huán)境中16 h，將溫度調節(jié)為16℃，然后將完成誘導的溶液置于離心機中，溫度4℃，轉速為5 000 g，離心10 min后將菌液沉淀用預冷的PBS洗后在4℃離心機內5 000 g離心10 min，重復5次。對細菌溶液進行在低溫狀態(tài)下超聲波破碎后（防止蛋白降解），通過SDS-PAGE電泳對細菌的全菌液、上清液及沉淀物對蛋白表達情況進行鑒定。蛋白膠泡在0.1 mmol·L-1KCL預冷溶液中顯色2 min，使用手術刀片小心的切下凝膠中染為銀白色的目的條帶，銀白色凝膠用PBS洗3次，洗掉目的條帶上的KCL溶液，碾碎膠加入適量的PBS，在-80℃反復凍融3次以上（蛋白凍融次數越多，回收效率越高）。凍融后的膠及PBS在4℃離心機內8 000 g離心10 min，最終得到純化的豬整合素β1重組蛋白，測定濃度用于后續(xù)的免疫實驗兔及ELISA抗原包被（若蛋白濃度過低，我們可以使用PEG8 000進行濃縮，獲得最合適的蛋白濃度），將純化的蛋白保存在-80℃冰箱。

1.4 豬整合素β1重組蛋白的鑒定

用純化的豬整合素β1重組蛋白SDS-PAGE電泳，230 mA電流在120 min內通過濕轉電泳法，完成轉膜之后將其封閉2 h，然后用PBST溶液對其進行清洗。將GST單克隆抗體1∶1 000作為一抗，將其置于4℃的環(huán)境中；將HRP-山羊抗鼠IgG 1∶10 000作為二抗，將其置于常溫中避光1 h，然后用PBST溶液對其進行清洗。最后通過掃描成像系統(tǒng)查看結果。

1.5 豬整合素β1重組蛋白抗體的制備

首先將經過純化的重組蛋白pGEX-6p-1-β1，用BCA法對其濃度進行檢測，按0.5 mg每只實驗兔將純化后的蛋白與佐劑按體積比1∶1進行混合，在低溫環(huán)境下使用旋渦振蕩器充分振蕩，乳化液體在清水中5 min內不出現擴散現象表明充分乳化。將乳化后的液體皮下多點注射2.0 kg左右的實驗兔背部。蛋白和弗氏完全佐劑混合為首次免疫，蛋白和弗氏不完全佐劑混合為二、三次免疫。實驗中各次免疫出現的時間相隔14 d左右。在開始實驗后的第7 d從兔的耳部靜脈處收集血液，采集血清，將免疫前的兔子血清作為對照組使用。在第三次免疫8 d后處死實驗兔取其全血后進行血清分離。

1.6 豬整合素β1重組蛋白抗體效價檢測

實驗中效價的檢測方法為間接ELISA法，首先用包被溶液對純化后的蛋白進行稀釋，稀釋后的溶液濃度為1μg·mL-1，然后將96孔板的每孔加入100μL稀釋后液體包被板子，在4℃的溫度過夜孵育（目的是特異抗原與固相載體結合用于后續(xù)實驗）。次日棄液，每孔使用300μL的PBST（0.01 mol·mL-1PBS，PH=7.4，0.05%Tween-20）進行洗滌，室溫振蕩3次，每次5 min。棄液后用5%的脫脂乳37℃恒溫箱內封閉2 h，每孔150μL。棄液用PBST每孔300μL，洗3次，每次5 min。以待檢陽性血清與未免疫實驗兔的陰性血清為一抗，用PBST進行稀釋，用方陣法確定一抗的最佳稀釋度。稀釋梯度按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400至1∶12 800。在每個孔內加入100μL血清稀釋液，37℃培養(yǎng)箱內作用1 h。將溶液去除后置于PBST中清洗，然后輕拍ELISA板去除清洗液。然后將孔板的所有孔中都加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）溶液100μL，然后將孔板再次放入37℃培養(yǎng)箱內作用1 h，將溶液去除后置于PBST環(huán)境中清洗，然后輕拍ELISA板去除清洗液。再次將孔板中加入TMB顯色液100μL，然后將其置于無光的室內，在常溫下放置10 min，然后向其中加入100μL的2 mol·L-1H2SO4終止液，此時底物顯色變黃，顏色越深代表抗體量越高。5 min內使用酶標儀測定每個孔在OD450nm的吸光度，記錄實驗結果，以便進行后續(xù)分析。計算陽性與陰性血清的OD450值之比（P/N），當P/N值小于1.5時血清為陰性，當大于或等于1.5而小于2.1為可疑血清，當大于或等于2.1時血清為陽性。所以在P/N值大于或等于2.1時的抗體血清最高的稀釋倍數為抗體效價。

1.7 豬整合素β1多克隆抗體的特異性鑒定

選用含天然整合素β1蛋白的仔豬小腸組織作為樣品進行Western blot方法分析。提取仔豬小腸組織總蛋白通過SDS-PAGE電泳將蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。5%的脫脂乳用PBST進行稀釋后在37℃封閉2 h，PBST充分洗滌。取出三免后的實驗兔多抗血清，將其加入到PBST溶液中稀釋成1∶1 000的比例，將此溶液作為一抗置于4℃的環(huán)境中過夜放置，用PBST洗滌后HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗置于常溫下放置1 h，用PBST溶液反復清洗3次。最后使用凝膠成像儀觀察結果，從而確認豬整合素β1多克隆抗體和天然整合素β1之間是否會產生反應。

2 結果與分析

2.1 豬整合素β1重組蛋白表達及純化結果

首先需要對豬整合素β1胞外區(qū)進行預測，通過CBS在線網站使用TMHMM-2.0工具，結果顯示豬整合素β1的胞外區(qū)為1～728位氨基酸（圖1）。尋找胞外區(qū)抗原性良好區(qū)域為后續(xù)蛋白表達奠定基礎，使用DNAStar軟件分析出豬整合素β1的26～728位氨基酸具有良好的抗原性（圖2）。基于大腸桿菌偏嗜性密碼子的基礎上對基因優(yōu)化后合成，把Bam HI酶切位點加到5'末端，把Xho I酶切位點加到3'末端，人工合成豬整合素β1核苷酸序列。將合成的基因與原核表達載體pGEX-6p-1連接起來，使用Bam HI和Xho I限制性內切酶對重組質粒pGEX-6p-1-β1雙酶切進行分析研究，試驗結果顯示，在2 109 bp和4 984 bp上，兩個片段的大小和預測基本相同，檢測結果如下（圖3）所示。將保存完好的質粒pGEX-6p-1-β1轉化至大腸桿菌的感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）中，加入0.6 mmol·L-1的IPTG誘導，完成后將其置于超聲環(huán)境中破碎，然后用聚乙酰胺凝膠進行電泳分析。結果顯示，在102 ku左右發(fā)現目的蛋白成功表達，且以包涵體的狀態(tài)存在。因此為了獲得純化蛋白實驗通過切膠純化的方法（圖4）。

圖1 豬整合素β1跨膜區(qū)預測Fig.1 Prediction of transmembrane helices of porcine integrinβ1

圖2 豬整合素β1抗原區(qū)預測Fig.2 Prediction of porcine integrinβ1 antigen region

圖3 pGEX-6p-1-β1合成質粒雙酶切鑒定結果Fig.3 Identification results of double digestion of pGEX-6p-1-β1 synthetic plasmid

圖4 豬整合素β1重組蛋白的表達與純化結果Fig.4 Expression and purification results of porcine integrinβ1 recombinant protein

2.2 豬整合素β1的抗原性分析

實驗中的抗原性分析的檢測方法為Western blot法，將經過純化的豬整合素β1重組蛋白經過Western blot分析后得出，pGEX-6p-1-β1重組蛋白它的原核表達載體pGEX-6p-1帶有GST標簽，鼠源的GST一抗能夠特異性結合GST標簽，說明純化蛋白是豬整合素β1的目的蛋白（圖5）。

圖5 純化豬整合素β1重組蛋白Western blot結果Fig.5 Western blot of purified porcine integrinβ1 protein

2.3 多克隆抗體效價檢測

使用間接ELISA法檢測效價，檢測結果顯示，豬整合素β1多克隆抗體效價為1∶12 800。

2.4 豬整合素β1抗體檢測效果

從仔豬的小腸部位中取出膜蛋白，該蛋白中含有天然的整合素β1，利用Western blot法對其抗原性進行分析，結果在130 ku左右有一條特異性條帶，與整合素β1蛋白大小相近，此結果說明制備的多克隆抗體能識別天然整合素β1蛋白（圖6）。

圖6 多抗與天然整合素β1蛋白反應性鑒定結果Fig.6 Results of identification of reactivity of polyclonal antibody with natural integrinβ1 protein

3 討論

整合素有許多功能，如在癌癥發(fā)生、免疫反應、血栓治療、炎癥、胚胎形成等方面都發(fā)揮重要作用，還可以作為受體在病毒與細胞的感染過程中發(fā)揮作用[22-23]。由于整合素廣泛分布于許多動植物細胞膜的表面，病毒顆粒感染宿主細胞過程中會直接或間接與整合素接觸，因此在病毒感染過程中整合素可能具有重要參與作用。目前，整合素可作為多種病毒的感染受體或感染相關蛋白，在病毒研究領域備受關注。目前有報道稱，整合素可以作為人類皰疹病毒、艾博拉病毒、免疫缺陷病毒、腺病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒等多種病毒的受體或共受體[11-16]。口蹄疫病毒感染受體研究中已被報道的有整合素 β1、β3、β6、β8，其中整合素β6能夠增強病毒感染[24-26]。PEDV是一種冠狀結構的病毒，自身帶有囊膜，當PEDV進入宿主細胞時，首先通過病毒表面的纖突糖蛋白和腸絨毛上的受體結合，二者通過膜融合的方式使病毒進入[27]。PEDV的敏感細胞Vero中有17種膜蛋白與病毒受體相關，包括整合素β1[28]。而且PEDV病毒粒子表面的纖突糖蛋白能夠識別整合素的不同配體序列[29]。豬整合素 αvβ3能夠在Vero、IEC細胞上促進PEDV感染[30]。豬整合素β1與β3都是整合素家族成員且同在于細胞表面，因此猜測在PEDV感染過程中豬整合素β1也可能發(fā)揮作用。為完成后續(xù)研究，試驗構建表達豬整合素β1的原核表達載體并制備多克隆血清用于PEDV入侵宿主細胞機制的驗證。

制備抗體主要是選擇蛋白合適的抗原區(qū)，蛋白的親水性、抗原性、可及性、二級結構以及疏水性等多種特性對抗原區(qū)域的選擇作為參考，其中蛋白的親水性與可及性對抗原表位的形成發(fā)揮重要的作用[31]。由于整合素β1胞外區(qū)的蛋白的主要作用是產生黏附，所以實驗先對整合素β1的跨膜區(qū)域進行了分析，然后對其分析出的胞外區(qū)進行抗原性預測，對胞外區(qū)具有很好的抗原性區(qū)域人工合成。實驗中選擇pGEX-6p-1原核表達載體，因為pGEX-6p-1載體的GST標簽不僅具有增加外源蛋白可溶性的作用，而且易于蛋白純化。在對豬整合素β1的表達后發(fā)現，在分子質量在102 ku時，出現了特異性條帶，這說明蛋白成功表達，但是重組蛋白的形式是包涵體的狀態(tài)。因此在制備多克隆抗體時，使用了KCL染色SDS-PAGA電泳切膠純化方法。通過切膠免疫法能實現蛋白的提取，而且提取出的蛋白不僅純度相對較高，完整性也相對較好。此外，通過此方法提取出的蛋白為包涵體蛋白，經過蛋白純化后可以直接免疫兔。為了制備出特異性強和高效價的豬整合素β1多克隆抗體，以實驗兔為研究對象，通過蛋白免疫法對其進行檢測，結果顯示，較核酸免疫效價更高，但是抗原持續(xù)發(fā)揮作用時間短，所以，試驗采用重復加強免疫，兩周免疫1次，共免疫3次或得高效價血清[32]。免疫動物過程中抗原中添加的弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑后改變其物理狀態(tài)，有利于增強抗原的免疫應答[33]。試驗制備的豬整合素β1多克隆抗體具有較高效價為1∶12 800，此多抗能夠通過Western blot方法特異性識別仔豬小腸上皮細胞中的整合素β1蛋白。試驗所制備豬整合素β1多克隆抗體也可通過間接免疫熒光的抗原抗體反應對細胞或組織中抗原的進行定位，為后續(xù)整合素β1與病毒定位和作用研究奠定物質基礎。

4 結論

試驗成功制備了特異性強和高效價的豬整合素β1多克隆抗體，該抗體的備制成功為后續(xù)豬整合素β1與豬病病毒感染等作用研究提供基礎。