陳婷，閆君，張文，彭濤，吳福祥

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究所（蘭州 730050）

中國有著悠久的飲食文化及中醫(yī)藥文化，藥食同源食品由于其兼?zhèn)淞霜毺氐臓I養(yǎng)與保健功效，近年來受到人們的廣泛青睞[1-2]。2019年衛(wèi)建委公布了按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)目錄，從原有101個品種新增至107種[3]，藥食同源產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)、應(yīng)用等活動也逐漸成為當(dāng)今熱點話題[4]。

藥食同源物質(zhì)以可食性植物為主，主要通過栽培種植獲得。為滿足市場的需求，在栽培過程中常盲目濫用禁限用農(nóng)藥防治病、蟲害，致使藥食同源類植物受到農(nóng)藥污染日益嚴(yán)重。農(nóng)藥殘留不僅影響藥食同源類產(chǎn)品在國際市場的貿(mào)易，更重要的是對人類健康造成威脅[5-6]。苯基吡唑類農(nóng)藥可以有效地殺死各種蟲類，曾被廣泛地運用到農(nóng)作物中，其中最常見的苯基吡唑類是丁蟲腈、氟蟲腈及其代謝物，人體攝入后會嚴(yán)重影響神經(jīng)系統(tǒng)并且會損傷肝臟、甲狀腺等，且產(chǎn)生較為明顯的富集現(xiàn)象[7-8]。我國要求自2009年7月1日起，除衛(wèi)生用、部分旱田種子包衣劑外，停止銷售和使用含有氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑，歐盟于2013年起對氟蟲腈實行限制使用，禁止氟蟲腈在食品產(chǎn)業(yè)畜禽養(yǎng)殖中使用，因此建立苯基吡唑類農(nóng)藥快速檢測方法尤為重要。目前，針對此類農(nóng)藥的檢驗方法較少，2015版《中國藥典》通則2341《農(nóng)藥殘留測定法》中只針對氟蟲腈一種化合物進(jìn)行檢測，且分析時間較長[9]。國標(biāo)方法只涉及雞蛋基質(zhì)中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法，此外其他行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用固相萃取法進(jìn)行檢驗，其操作過程復(fù)雜，耗時長，回收率不穩(wěn)定。近年來QuEChERS方法在農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用較廣，常用的凈化材料主要有十八烷基鍵合硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、多壁碳納米管（MWCNTs）等[10]。石墨化多壁碳納米管（Graphitized multi-wall carbon nanotubes，GMWCNTs）是一種新型納米材料，由于具有納米級別的中空管結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，表現(xiàn)出獨特的吸附能力，經(jīng)高溫石墨化處理可以有效減小納米管粉體內(nèi)的非晶碳，進(jìn)而消除管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的缺陷[11-12]。目前，利用GMWCNTs作為凈化材料在藥食同源食品農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域鮮有報道。因此，試驗采用新興凈化材料GMWCNTs并結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立藥食同源食品中苯基吡唑類農(nóng)藥的快速檢測方法，為相關(guān)監(jiān)管部門的日常抽檢和風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Iclass/Xevo TQD高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源、三重四極桿線性離子阱質(zhì)量分析器及MassLynx 4.1工作站，美國Waters公司）；SiO-6512 QuEChERS全自動樣品制備系統(tǒng)（配有渦流振動離心機(jī)，12位均質(zhì)離心轉(zhuǎn)子，均質(zhì)分離工作站，北京ABILITY公司）；EVA50A氮吹儀（北京普立泰科儀器有限公司，中國）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；Centrifuge 5810R高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；VORTEX-5渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；ME204/02電子天平（美國梅特勒公司）。

乙腈、丙酮、甲醇、甲酸（色譜純，德國Merck公司）；試驗用水（美國Millipore公司）；提取劑包（4.0 g無水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，1.0 g檸檬酸鈉，0.50 g檸檬酸二鈉，均為分析純）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化多壁碳納米管（GMWCNTs）、聚丙烯整合管、ZrO2珠包（北京Ability公司）；石墨化氨基固相萃取柱（美國安捷倫公司）；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，德國Dr Ehrenstorfer公司）。

1.2 試驗條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

分別準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg）丁蟲腈、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，于-18 ℃避光保存。用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光保存，備用。

1.2.1.2 空白基質(zhì)溶液的制備

取空白樣品，按1.2.3小節(jié)處理，過0.22 μm微孔濾膜后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試樣制備

樣品干燥后粉碎處理，過50目篩（篩孔0.300 mm），在常溫下保存。

1.2.3 試驗方法

準(zhǔn)確稱取2 g試樣，精確至0.01 g，分別至整合管外管，依次加入5 mL超純水、ZrO2珠包（24粒）、10.0 mL乙腈、6.5 g QuEChERS鹽包。將裝有凈化劑的內(nèi)管（凈化劑為0.9 g MgSO4、0.2 g PSA、0.18 g GMWCNTs）放入整合管并擰緊，放入SiO-6512主機(jī)中。運行方法：第Ⅰ步，1 100 r/min震動5 min；第Ⅱ步，以4 000 r/min離心10 min；第Ⅲ步，以1 100 r/min振動5 min；第Ⅳ步，以4 000 r/min離心5 min。程序結(jié)束后取出整合管，準(zhǔn)確吸取1.00 mL上清液過0.22 μm微孔濾膜，待LC-MS/MS測定。

1.2.4 儀器方法

1.2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm I.D.×100 mm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；流速0.3 mL/min；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫：0～0.5 min，5% A；0.5～8.5 min，5%～95% A；8.5～10.0 min，95% A；10.0～12.0 min，5% A。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧離子源（ESI-）；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；去溶氣溫度500 ℃；去溶氣流速900 L/Hr；毛細(xì)管電壓3.00 kV；錐孔電壓45 V；離子源溫度150 ℃；碰撞氣，高純氬氣（99.999%）。各農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 苯基吡唑類農(nóng)藥的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化劑種類及用量的優(yōu)化

藥食同源食品基質(zhì)較為復(fù)雜，存在多糖、有機(jī)酸、脂肪酸、色素等干擾物，試驗選擇MgSO4、PSA、GMWCNTs作為凈化材料，通過對比不同凈化劑含量、組合對目標(biāo)化合物回收率的影響，得出最佳的凈化劑組合。

2.1.1 無水硫酸鎂使用量的優(yōu)化

MgSO4可以有效降低有機(jī)相中的水分，有利于GMWCNTs與樣品雜質(zhì)結(jié)合，提高凈化效率。試驗使用2.0 g肉桂空白樣品，通過加標(biāo)回收優(yōu)化無水硫酸鎂的使用量。凈化劑由200 mg PSA、180 mg GMWCNTs及不同量的MgSO4（800，900，1 000和1 100 mg）組成。如圖1所示，隨著MgSO4用量的增加，各農(nóng)藥的回收率逐漸增高，當(dāng)MgSO4用量達(dá)到900 mg時，除氟蟲腈砜以外的化合物回收率均變化不大。為了達(dá)到較好的脫水效果且考慮試驗成本，選擇無水硫酸鎂的用量900 mg。

圖1 不同無水硫酸鎂用量對肉桂中農(nóng)藥回收率的影響

2.1.2 PSA使用量的優(yōu)化

將2.0 g肉桂空白樣品按1.2.3小節(jié)處理，通過加標(biāo)回收優(yōu)化PSA使用量。凈化劑由900 mg MgSO4、180 mg GMWCNTs及不同量的PSA（100，150，200和250 mg）組成，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)PSA含量較低時，各化合物回收率較低；隨著PSA含量的增加，化合物的回收率逐漸增加；當(dāng)PSA含量為200 mg時，回收率趨于穩(wěn)定。因此，試驗選擇200 mg PSA作為凈化最佳用量。

圖2 不同PSA用量對肉桂中農(nóng)藥回收率的影響

2.1.3 GMWCNTs使用量的優(yōu)化

將2.0 g肉桂空白樣品，按1.2.3小節(jié)處理，通過加標(biāo)回收優(yōu)化GMWCNTs使用量。凈化劑由900 mg MgSO4、200 mg PSA及不同量的GMWCNTs（60，100，140，180和220 mg）組成，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)GMWCNTs用量為60 mg時，丁蟲腈、氟蟲腈、氟蟲腈砜回收率均小于80%；當(dāng)用量為180 mg時，各化合物回收率均接近100%。因此，試驗選擇180 mg GMWCNTs作為凈化最佳用量。

圖3 不同GMWCNTs用量對肉桂中農(nóng)藥回收率的影響

2.2 與傳統(tǒng)固相萃取方法的比較

為了驗證改良QuEChERS方法的凈化效果，將其與傳統(tǒng)固相萃取方法（采用石墨化氨基固相萃取柱凈化）進(jìn)行比較。向肉桂空白樣品中添加50.0 μg/kg濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對比兩種方法的凈化效果。圖4（a）和（b）分別顯示了未經(jīng)凈化處理的肉桂樣品MRM色譜圖與傳統(tǒng)的固相萃取法處理的樣品溶液色譜圖。通過與改良QuEChERS方法凈化后的肉桂樣品色譜圖（圖4c）比較可以看到干擾峰的背景明顯降低，說明該方法對于樣品中含有的多糖、有機(jī)酸、醛類、酯類等極性和弱極性物質(zhì)均能達(dá)到良好的凈化效果。

圖4 采用不同凈化方式處理后的各農(nóng)藥總離子流色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在質(zhì)譜法檢測過程中，樣品中的基質(zhì)成分對目標(biāo)化合物的離子化有一定的增強(qiáng)或抑制作用，進(jìn)而影響測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。試驗通過比較肉桂、金銀花、山藥、葛根空白基質(zhì)與乙腈配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的斜率，評價基質(zhì)效應(yīng)。公式：ME=mmatrix/msolvent×100%，其中ME為基質(zhì)效應(yīng)，mmatrix、msolvent分別為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小。表2顯示：不同化合物在不同基質(zhì)中存在不同的基質(zhì)效應(yīng)，不同的樣品基質(zhì)中肉桂基質(zhì)效應(yīng)較大，5種化合物中氟蟲腈基質(zhì)效應(yīng)最為顯著。因此，試驗采用相近空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行校正。

2.4 方法的線性范圍及檢出限

試驗利用優(yōu)化的分析方法，分別用陰性樣品空白基質(zhì)配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)UPLC-MS/MS檢測，以化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向陰性樣品中添加目標(biāo)化合物，以樣品峰響應(yīng)值為3倍和10倍噪音的添加濃度作為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果顯示：苯基吡唑類化合物的色譜峰面積（y）與其質(zhì)量濃度（x，ng/mL）在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。方法的檢出限在2.00～4.38 μg/kg之間，定量限在5.99～13.15 μg/kg之間，結(jié)果見表2。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)及檢出限、定量限

2.5 方法的回收率及精密度

選用陰性樣品肉桂、金銀花、山藥、葛根，分別向其中添加20.0，40.0和80.0 μg/kg三個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平做5次平行，采用基質(zhì)匹配標(biāo)曲進(jìn)行定量分析，考察方法的回收率和精密度。由表3可知，苯基吡唑類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在68.8%～128.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）＜10.3%。

表3 不同基質(zhì)中各農(nóng)藥的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.6 實際樣品檢測

采用試驗建立的分析方法對市售的金銀花、枸杞、葛根、肉桂、山藥、菊花6種藥食同源食品的50批次樣品進(jìn)行了檢測，其中1批次金銀花中檢出0.018 mg/kg氟蟲腈，其余樣品均未檢出。

3 結(jié)論

采用石墨化多壁碳納米管作為前處理凈化劑，并結(jié)合UPLC-MS/MS建立了針對藥食同源性食品中苯基吡唑類農(nóng)藥的改良QuEChERS檢測方法。該方法與傳統(tǒng)的固相萃取法相比，凈化效果良好，有效降低了藥食同源食品中色素、多糖等大分子物質(zhì)的干擾，同時使用全自動QuEChERS樣品制備系統(tǒng)，避免了前處理過程中人為操作帶來的誤差，進(jìn)一步簡化了試驗過程。該方法操作簡便有效、準(zhǔn)確可靠，可用作藥食同源食品中苯基吡唑類農(nóng)藥殘留的參考檢測方法。