熊 雯 易路遙 晏 亮 程一鑫 楊婷婷 郭春梅 虞雪軍 章 紅

(江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心, 南昌 330029)

氟蟲腈，英文通用名為fipronil，商品名為銳勁特(Regent)，分子式：C12H4Cl2F6N4OS，分子量：437.2，是由原法國羅納-普朗克公司于1987年開發(fā)的苯基吡唑類高效廣譜性殺蟲劑。

氟蟲腈在環(huán)境中主要以水解、光解及微生物降解為主，現已發(fā)現的代謝產物有9種[1]，其中，氟蟲腈砜、氟甲腈、氟蟲腈亞砜是目前關注最多的三種代謝物[2-4]。在大鼠、小鼠以及人體內，氟蟲腈的主要代謝產物是氟蟲腈砜[5]，在植物、土囊代謝中，氟甲腈是最重要的光解產物[6]；在水生態(tài)中，通過生物與非生物共同作用，氟蟲腈主要降解成氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜[7，8]。研究表明，氟蟲腈砜作用于γ-氨基丁酸受體，毒性比母體大6倍； 氟甲腈對小鼠及家蠅的毒性與氟蟲腈差不多；然而這3種代謝產物都不容易進一步降解 ，因此對環(huán)境危害遠遠大于母體氟蟲腈[6,9，10]。

2017年8月，持續(xù)發(fā)酵的“毒雞蛋”事件，在45個國家發(fā)現了受氟蟲腈污染的雞蛋或蛋品，包括歐盟26國、中國香港、美國、俄羅斯、南非和土耳其等國家或地區(qū)。針對蛋中氟蟲腈及其代謝物的限量，我國暫未做出規(guī)定，GB2763—2016《食品中農藥最大殘留限量》中僅規(guī)定了氟蟲腈(以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜之和計)在24項植物源性食品中殘留限量標準，限量在0.02～0.1mg/kg之間[11]；中國香港特別行政區(qū)《食物內除害劑殘余規(guī)例》規(guī)定了蛋類氟蟲腈(以氟蟲腈與氟蟲腈砜之和計)最大殘留限量為0.02mg/kg[12]；澳大利亞新西蘭食品管理局規(guī)定蛋類氟蟲腈(以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜之和計)最大殘留限量為0.02mg/kg[13]；日本肯定列表中規(guī)定蛋類氟蟲腈最大殘留限量為0.02mg/kg[14]；歐盟規(guī)定蛋類氟蟲腈(以氟蟲腈與氟蟲腈砜之和計)最大殘留限量為0.005mg/kg[15]。

QuEChERS方法是一種簡單、省時、省力、廉價、成本低、試劑用量小、檢測范圍廣、高效的樣品前處理技術；液相色譜-串聯質譜因其高選擇性、高靈敏度成為農藥殘留分析中最常用的檢測技術。目前QuEChERS結合液相色譜-串聯質譜法已被國內外農藥獸藥殘留分析機構廣泛采納。本實驗采用Querchers方法對雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋進行前處理，運用液相串聯質譜三重四級桿的MRM模式檢測氟蟲腈及其3種代謝物，并采集雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋共159批次樣品進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-TQS質譜儀，色譜柱-C18(美國Waters)；離心機(美國ThermoFisher)；渦旋混合器(德國IKA)。

氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準品購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度均大于98%；氟甲腈購自農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，含量100mg/L；乙腈、甲醇等有機試劑均為色譜純(Sigma)；NaCl為分析純(國藥集團)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)(島津公司)

1.2 材料

雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋(市售)

1.3 標準溶液的制備

分別準確稱取氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準品10mg于100mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解，用乙腈定容至刻度，配制濃度為100 mg/L 的單標儲備液，于-20℃條件下儲存。氟蟲腈及其代謝物標準混合使用液( 5 mg/L) 由乙腈稀釋氟蟲腈及其代謝物單標儲備液制得。分別精密吸取混合標準使用液適量，置10ml容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度,搖勻得到10，20，50，100，200和500μg/L的系列混合標準工作溶液，于 4 ℃ 條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 色譜-質譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色譜柱；柱溫30℃；進樣量:2μL；流動相:A相為水，B相為乙腈。流速：0.4mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的洗脫程序

離子源：ESI源；掃描方式：MRM負離子模式；毛細管電壓：1500V；干燥氣溫度500℃，干燥氣流速800L/h；錐孔氣流速 150L/h；氟蟲腈及其代謝物的質譜信息見表2。

表2 氟蟲腈及其代謝物的質譜信息

續(xù)表2

1.5 樣品前處理

稱取5g經均漿后的樣品，準確加入5mL1%甲酸水溶液，振蕩30s，加入3.0g NaCl，渦旋30s，8000r/min離心5min，取1mL上清液，待凈化。將1mL上清液轉移至2mL凈化管中(含PSA 50mg、C1850mg、MgSO4100mg)，渦旋30s，10000r/min 離心1min，取上清液，過0.22μm濾膜，上機分析。

2 結果與討論

2.1 樣品提取溶劑的選擇

文獻報道[4,16,17]的氟蟲腈及其代謝物的提取溶劑一般采用乙腈、酸化乙腈、乙腈水溶液,考慮鮮蛋含水量超過80%，實驗僅考察了乙腈、含1%甲酸乙腈以及含5%甲酸乙腈的提取效率，結果發(fā)現，純乙腈對4個化合物的平均提取率僅為79.3%，而酸化乙腈具有較好的提取效果。這可能是由于氟蟲腈及其代謝物屬于弱堿性化合物，更易溶于酸性溶劑的原因。對比含1%甲酸乙腈與含5%甲酸乙腈，發(fā)現兩種溶劑提取效果相差無幾，各化合物回收率均達83%以上。因此，選用含1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 氯化鈉質量的選擇

鮮蛋經1%甲酸乙腈振蕩提取，得到乙腈水混合提取溶液，加入一定量的氯化鈉鹽析分層，能使乙腈層更好的沉淀鮮蛋中的蛋白質。實驗采用5mL1%甲酸乙腈溶液，3g氯化鈉，發(fā)現乙腈與水溶液能快速分層，目標物回收率均達到85%以上，且乙腈層較為澄清。

2.3 QuEChERS凈化條件的優(yōu)化

PSA通過氫鍵和化合物作用，可去除脂肪酸、部分有機酸、糖和色素。C18吸附劑是在硅膠基質上接有十八烷基，對油脂、甾醇和維生素的去除效果顯著。結合鮮蛋基質特性以及氟蟲腈類化合物的理化性質，本實驗采用混合型凈化劑結合無水硫酸鎂進一步除水，并對PSA、C18和無水硫酸鎂用量進行優(yōu)化，結果表明50mgPSA，50mgC18、100mg無水硫酸鎂時目標化合物平均回收率最高，同時各化合物的回收率均到達88%以上，本實驗室采用該組合作為最佳QuEChERS凈化劑。

2.4 色譜條件的選擇和優(yōu)化

本實驗采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色譜柱，考察了甲醇-水與乙腈-水兩種流動相，試驗發(fā)現，使用乙腈-水作為流動相，化合物整體峰型較好；部分文獻報道水相溶劑添加甲酸，本實驗對比發(fā)現水相添加甲酸后，氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜響應略有抑制，尤其是氟蟲腈，其響應值降低更為明顯。因此，選用乙腈-水作為流動相。氟蟲腈及其代謝物的離子流圖見圖1。

2.5 方法學驗證

2.5.1線性范圍與檢出限

選用不含待測組分的空白基質樣品，分別加入混合標準工作液(10、20、50、100、200和500μg/L)各500μL，渦旋混勻，靜置30min后，經1.5節(jié)樣品前處理，獲得基質標準溶液(濃度為1、2、5、10、20和50μg/kg)，繪制標準工作曲線。以峰面積為縱坐標y，濃度為橫坐標x，各目標化合物在1～50μg/kg范圍內線性關系良好，相關系數(r) 為0.9960～0.9981。在基質空白樣品中添加標準溶液，以信噪比 S/N≥3確定方法檢出限(LOD)，氟蟲腈及其代謝物方法檢出限達到0.1～0.2μg/kg，具體結果見表3。

圖1 氟蟲腈及其代謝物的離子流圖

名稱基質線性回歸方程相關系數r檢出限(LOD)氟蟲腈溶劑y=10351.4x-286.2190.99880.1雞蛋y=10167.2x+788.3410.99770.1氟甲腈溶劑y=5984.42x+168.4050.99910.2雞蛋y=6001.76x-771.7260.99810.2氟蟲腈亞砜溶劑y=5263.13x+101.5020.99890.2雞蛋y=4848.05x+631.8010.99600.2氟蟲腈砜溶劑y=10803.5x+783.4630.99830.1雞蛋y=9908.57x+824.8450.99710.1

2.5.2回收率

以空白樣品做添加回收實驗，在雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋空白樣品中分別添加不同量的混合標準溶液(添加水平分別為5、10、20μg/kg)，每個濃度設置2個平行樣，按上述優(yōu)化的實驗方法測定氟蟲腈及其3種代謝物的回收率。三類鮮蛋產品中，氟蟲腈及其3種代謝物的回收率在88.1%～110.5%之間，結果見表4。

表4 不同基質中各化合物的回收率

續(xù)表4

2.6 基質效應評價

液相色譜-串聯質譜中的基質效應由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現為離子增強或抑制作用[18]。實驗以基質匹配校準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率考察不同化合物的基質效應，其比值越接近1，則基質效應越小[19]。分別比較純試劑和雞蛋、鴨蛋以及鵪鶉蛋三種不同基質配置標準曲線溶液的基質效應。結果表明，在3種鮮蛋基質中，氟蟲腈及其3種代謝物的基質效應在85.5%～108.2%之間，基質效應均不明顯，結果見表5。

表5 不同基質中各化合物的基質效應

2.7 實際樣品的測定

本實驗在江西省3個城市抽取了159批次樣品進行了氟蟲腈及代謝物的監(jiān)測，包括85批次雞蛋、43批次鴨蛋、31批次鵪鶉。其中，13批次雞蛋檢出氟蟲腈砜，含量在0.00056～0.0012mg/kg之間；14批次鴨蛋檢出氟甲腈, 含量在0.00050～0.0011mg/kg之間；7批次鵪鶉蛋檢出氟蟲腈砜，含量在0.00056～0.0021mg/kg之間。結果表明氟蟲腈及其代謝物的檢出均遠遠低于國際限量。

試驗同時考察了氟蟲腈代謝物在鮮蛋的分布情況，選擇含氟蟲腈代謝產物的3批雞蛋、1批鴨蛋進行了蛋黃、蛋清含量的比較實驗，結果發(fā)現僅蛋黃檢出氟蟲腈代謝產物，而蛋清未檢出該類物質。這這說明氟蟲腈代謝物易富集于蛋黃中。

3 結論

建立了針對3種鮮蛋基質中氟蟲腈及其3種代謝物的液相-質譜的定量和定性方法，對提取試劑、凈化吸附劑條件進行優(yōu)化，并對基質效應及方法學進行評價，本實驗方法將QuEChERS 前處理與質譜檢測結合，實現鮮蛋中目標化合物的快速準確定量分析，在合理安排時間的情況下，3小時內可以完成5～6批檢品中氟蟲腈及其代謝物的準確測定。