耿 路，張?jiān)娨猓位哿?/p>

（西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosisi，AS）是一種臨床上常見的血管病變，是諸多缺血性心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，是全世界最主要的致死原因之一[1]。迄今為止，有關(guān)AS的發(fā)病機(jī)制已有許多學(xué)者各抒己見衍生出許多不同學(xué)說，如脂質(zhì)浸潤、損傷免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)及血流動(dòng)力學(xué)學(xué)說等[2]，然而AS的病理機(jī)制復(fù)雜，任意一種學(xué)說均不能單獨(dú)全面的解釋其完整的發(fā)生機(jī)制。異常血脂是AS發(fā)生發(fā)展最重要的因素。大量流行病學(xué)資料顯示AS的嚴(yán)重程度與血清總膽固醇（total cholesterol，TC）水平呈正相關(guān)，低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高是AS 重要的病理基礎(chǔ)，在血脂異常中扮演重要角色[3]。而高密度脂蛋白膽固醇（high-den?sity lipoprotein cholesterol，HDL-C）是AS 的保護(hù)因素，有益于心血管，升高HDL-C水平可作為抗AS的治療靶點(diǎn)[4]。因此降低血清TC、LDL-C，升高HDL-C對防治AS有積極意義，且大量臨床研究表明中醫(yī)藥在心腦血管疾病防治方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。

蛭龍活血通瘀膠囊是本院楊思進(jìn)教授結(jié)合中醫(yī)藥理論及多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)研發(fā)的院內(nèi)制劑，由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝組成，具有化痰通絡(luò)、益氣活血的功效。前期工作表明其具有良好的抗AS作用[5]，但對蛭龍活血通瘀膠囊拆方組分防治AS 的研究尚未涉及。本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠AS 模型，觀察了蛭龍活血通瘀膠囊及其拆方對AS大鼠血脂四項(xiàng)、主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)及內(nèi)膜厚度的影響，篩選出其抗AS的主要藥味，精簡組方，探討其作用機(jī)制，并為該藥臨床廣泛應(yīng)用于防治AS提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠110 只，體重（200 ±10）g，西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

蛭龍活血通瘀膠囊組成（免煎顆粒）：黃芪（每袋裝1.1 g）、桂枝（每袋裝0.3 g）、大血藤（每袋裝0.6 g）、地龍（每袋裝1.0 g）、水蛭（每袋裝0.3 g），均購自四川新綠色藥業(yè)科技公司。阿托伐他汀鈣10 mg/片，維生素D3注射液7.5 mg/mL，丙硫氧嘧啶50 mg/片等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材

膽酸鈉、膽固醇、卵清蛋白、牛血清蛋白、多聚甲醛、無菌注射器、灌胃針、手套、口罩、生理鹽水等。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

高溫低速離心機(jī)、正置熒光顯微鏡、Leica 切片機(jī)、生物組織包埋機(jī)、全自動(dòng)生化分析儀、病理圖像采集成像系統(tǒng)等。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 正交設(shè)計(jì)分組 本實(shí)驗(yàn)主要研究蛭龍活血通瘀膠囊中黃芪（A）、桂枝（B）、大血藤（C）、地龍（D）、水蛭（E）這五味組成藥物，拆方組用這五個(gè)因素，取“用藥”“不用藥”水平，分別以“1”和“0”表示，采用正交設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)出拆方1～7號(hào)方（表1）。

表1 蛭龍活血通瘀膠囊正交設(shè)計(jì)表

將適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的健康清潔級(jí)SD大鼠110只隨機(jī)分為空白組、模型組、阿托伐他汀組、全方組、拆方1～7 號(hào)組，每組10 只，每籠5 只。

1.5.2 建立模型 參照張安邦等[6]探索的復(fù)合方法制備SD大鼠AS模型。各組大鼠飼養(yǎng)120 d后取材。

1.5.3 藥物干預(yù) 造模60 d后，藥物干預(yù)組予以不同藥物干預(yù)，各藥物等效劑量換算按照原方體重為60 kg 成人劑量的6.17 倍的計(jì)算比例[7]，各組按照10 mL·kg-1·d-1的量予以懸液[8]，每日灌服1次，持續(xù)60 d。

1.5.4 取材及檢測指標(biāo) 末次給藥后，采集腹主動(dòng)脈約5 mL 血液，于離心機(jī)中以3000 rpm/min 離心10 min，分離血清。生化分析法檢測TC、甘油三酯（tri?glyceride，TG）、LDL-C、HDL-C的含量。

取血后，剪取約2 cm 長的胸主動(dòng)脈，清理附著組織，生理鹽水沖洗后用4%甲醛固定24 h，制作病理切片，經(jīng)HE 染色后，在光鏡下觀察胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化，隨機(jī)選取四個(gè)視野，用IPP 6.0 圖像分析系統(tǒng)測量胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度（IT）。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，本實(shí)驗(yàn)所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，正交試驗(yàn)結(jié)果通過直觀和方差分析法進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對AS大鼠血清血脂四項(xiàng)的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C值明顯升高，HDL-C 值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，除拆6、7號(hào)組外，余各藥物組的大鼠血清TG、TC、LDL-C值均明顯降低，HDL-C 值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組與拆6、7 號(hào)組相比血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；蛭龍活血通瘀膠囊全方組（即全方組）與各拆方組相比，血清TG、TC、LDL-C值均明顯降低，HDL-C值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；拆2 號(hào)組與余各拆方組相比，血清TG、TC、LDL-C值均明顯降低，HDL-C 值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同理，拆1 號(hào)組與剩余各拆方組相比，大鼠血清TG、TC、LDL-C 值均明顯降低，HDL-C 值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；拆3 號(hào)組與拆4、5號(hào)組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值無明顯差異（P ＞0.05），而拆3號(hào)組與拆6、7號(hào)組相比，其大鼠血清TG、TC、LDL-C 值均明顯降低，HDL-C 值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；拆6 號(hào)組與拆7 號(hào)組相比較，血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 值無明顯差異（P ＞0.05）。全方組與阿托伐他汀組相比，血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 值無明顯差異（P ＞0.05）；各拆方組與阿托伐他汀組相比，大鼠血清TG、TC、LDL-C值均明顯升高，HDL-C值均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、3。

表2 各組大鼠血清TC、TG值的比較（n=10，mmol/L，）

表2 各組大鼠血清TC、TG值的比較（n=10，mmol/L，）

注：a 與空白組比較P＜0.05；b 與模型組比較P＜0.05；c與阿托伐他汀組比較P＜0.05；d與全方組比較P＜0.05；e與拆1號(hào)組比較P＜0.05；f與拆2號(hào)組比較P＜0.05；g與拆3號(hào)組比較P＜0.05；h與拆4號(hào)組比較P＜0.05；i與拆5號(hào)組比較P＜0.05；j與拆6 號(hào)組比較P＜0.05；k與拆7號(hào)組比較P＜0.05

表3 各組大鼠血清LDL-C、HDL-C值的比較（n=10，mmol/L，）

表3 各組大鼠血清LDL-C、HDL-C值的比較（n=10，mmol/L，）

注：a與空白組比較P＜0.05；b與模型組比較P＜0.05；c與阿托伐他汀組比較P＜0.05；d與全方組比較P＜0.05；e與拆1號(hào)組比較P＜0.05；f與拆2號(hào)組比較P＜0.05；g與拆3號(hào)組比較P＜0.05；h 與拆4 號(hào)組比較P＜0.05；i 與拆5 號(hào)組比較P＜0.05；j 與拆6 號(hào)組比較比較P＜0.05；k 與拆7 號(hào)組比較P＜0.05

2.2 藥物對AS 大鼠血清血脂四項(xiàng)影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取各組大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C 值的平均值，根據(jù)正交設(shè)計(jì)表分別計(jì)算各列K 值和R 值，K 值表示各藥物組分采用或不采用時(shí)血脂指標(biāo)的平均值，R 值的大小反應(yīng)各藥物成分對血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值影響的大小。

根據(jù)計(jì)算血清TC、LDL-C 的R 值，TC：R黃芪為1.44，R桂枝為0.67，R大血藤為0.2，R地龍為0.65，R水蛭為0.65；LDL-C：R黃芪為0.83，R桂枝為0.47，R大血藤為0.08，R地龍為0.31，R水蛭為0.31，排列出各因素對血清TC及LDL-C 值影響的大小順序均是黃芪＞桂枝＞地龍=水蛭＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中發(fā)揮降低血清TC、LDL-C 作用的藥味主要是黃芪、地龍、水蛭、桂枝。據(jù)方差結(jié)果顯示證實(shí)這一結(jié)果：全方中黃芪明顯降低血清TC、LDL-C 值（P＜0.01），桂枝、水蛭、地龍降低血清TC、LDL-C 值作用較黃芪弱（P＜0.05），而大血藤無明顯降低血清TC、LDL-C 值作用（P ＞0.05）。

同理計(jì)算血清TG 的R 值，R黃芪為0.83，R桂枝為0.39，R大血藤為0.09，R地龍為0.25，R水蛭為0.29，排列出各因素對血清TG 值影響的大小順序是黃芪＞桂枝＞水蛭＞地龍＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中發(fā)揮降低血清TG作用的藥味主要是黃芪、水蛭、地龍、桂枝。據(jù)方差結(jié)果顯示證實(shí)這一結(jié)果：全方中黃芪明顯降低血清TG 值（P＜0.01），桂枝、水蛭、地龍降低血清TG 值作用較黃芪弱（P＜0.05），而大血藤無明顯降低血清TG值作用（P ＞0.05）。

同理計(jì)算血清HDL-C 的R 值，R黃芪為0.38，R桂枝為0.22，R大血藤為0.03，R地龍為0.2，R水蛭為0.22，排列出各因素對血清HDL-C 值影響的大小順序是黃芪＞桂枝=水蛭＞地龍＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中發(fā)揮升高血清HDL-C作用的藥味主要是黃芪、水蛭、地龍、桂枝。據(jù)方差結(jié)果顯示證實(shí)這一結(jié)果：全方中黃芪、桂枝、地龍、水蛭明顯升高血清HDL-C 值（P＜0.01），而大血藤無明顯升高血清HDL-C 值作用（P ＞0.05）。

2.3 藥物對AS大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響

觀察光鏡下組織切片，空白組：正常主動(dòng)脈血管壁，內(nèi)膜無脂質(zhì)沉積，各層結(jié)構(gòu)清晰，少量平滑肌纖維及膠原纖維穿插其中，細(xì)胞排列正常，彈力纖維分布均勻，無泡沫細(xì)胞及纖維化等病理改變。模型組：動(dòng)脈血管壁凹凸不平，內(nèi)膜增厚、水腫向腔內(nèi)凸起，內(nèi)皮下可見大量泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積，少許炎性細(xì)胞浸潤，平滑肌萎縮，排列紊亂，中膜部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，彈力纖維斷裂，外膜可見少許結(jié)締組織增生，形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。與空白組比較，模型組的AS 病變明顯。除拆方6 號(hào)組、拆方7 號(hào)組外，各藥物組的病變程度較模型組輕，能不同程度的抑制AS 進(jìn)展，保護(hù)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，其作用主要表現(xiàn)在減少炎性因子生成，抑制泡沫細(xì)胞的形成、聚集及脂質(zhì)沉積，保護(hù)平滑肌細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，抑制纖維化等。其中對胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變保護(hù)作用最佳的藥物組是阿托伐他汀組和全方組，而拆方6 號(hào)組、拆方7 號(hào)組對大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)保護(hù)作用不明顯，且拆方2號(hào)組優(yōu)于余各拆方組。（見圖1）

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)結(jié)果（HE染色，× 400）

2.4 藥物對AS大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的影響

2.4.1 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的比較 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度用圖像分析儀檢測，模型組較空白組內(nèi)膜增厚明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；除拆6、7 號(hào)組之外的其他藥物干預(yù)組比模型組內(nèi)膜明顯變薄，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；拆6、7號(hào)組與模型組相比內(nèi)膜厚度無明顯差異（P ＞0.05）。與相比，各拆方組內(nèi)膜較阿托伐他汀組明顯增厚，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。阿托伐他汀組與全方組內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。與全方組相比，各拆方組內(nèi)膜明顯增厚，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；拆方組中，拆2 號(hào)組內(nèi)膜厚度較其他拆方組明顯變薄，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。拆1號(hào)組較拆3、6、7號(hào)組內(nèi)膜明顯變薄，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），拆1 號(hào)組與拆4、5 號(hào)組的內(nèi)膜厚度無明顯差異（P ＞0.05）。拆3號(hào)組的內(nèi)膜厚度較拆6、7 號(hào)組明顯變薄，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；拆6 號(hào)組和拆7 號(hào)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。（見表4，圖2）

圖2 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（，μm）

表4 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（n=10，μm，）

表4 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（n=10，μm，）

注：a與空白組比較P＜0.05；b與模型組比較P＜0.05；c與阿托伐他汀組比較P＜0.05；d與全方組比較P＜0.05；e與拆方1 號(hào)組比較P＜0.05；f 與拆方2 號(hào)組比較P＜0.05；g 與拆方3號(hào)組比較P＜0.05；h與拆4號(hào)組比較P＜0.05；i與拆5號(hào)組比較P＜0.05；j 與拆6 比較P＜0.05；k 與拆7 比較P＜0.05

2.4.2 藥物對大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度影響的正交試驗(yàn)結(jié)果 取各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的平均值分析，根據(jù)正交設(shè)計(jì)表計(jì)算各列K 值和R 值，K 值表示各藥物組分采用或不采用時(shí)大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的平均值，R 值的大小表示各藥物成分對大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度影響的大小。

計(jì)算大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的R 值，R黃芪為11.48，R桂枝為8.10，R大血藤為2.8，R地龍為8.00，R水蛭為8.92，排列出各因素對大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度值影響的大小順序：黃芪＞水蛭＞桂枝＞地龍＞大血藤，可見蛭龍活血通瘀膠囊中黃芪、地龍、水蛭、桂枝發(fā)揮使大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜變薄作用。據(jù)方差結(jié)果顯示證實(shí)這一結(jié)果：全方中黃芪、地龍、水蛭、桂枝有抑制大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚作用（P＜0.05），桂枝、水蛭、地龍降低血清TG 值作用較黃芪弱（P＜0.05），而大血藤無此作用（P ＞0.05）。

3 討論

研究證實(shí)[9]脂質(zhì)代謝障礙是AS病變的基礎(chǔ)，TC、TG 代謝紊亂與臨床密切相關(guān)。TC 升高能聚集在血管壁逐步形成膽固醇結(jié)晶，刺激炎癥因子生成誘發(fā)血管炎性反應(yīng)，使血管內(nèi)皮功能紊亂，促使AS發(fā)生[10]。許多研究[11]表明LDL 和HDL 的結(jié)構(gòu)改變可能是TG升高致動(dòng)脈粥樣硬化作用的主要原因。LDL-C 增高是AS發(fā)生、發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[12-13]，LDL在破損的血管內(nèi)皮下被氧化形成氧化型LDL（Ox-LDL），經(jīng)巨噬細(xì)胞吞噬后形成大量泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞聚集、融合構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心，促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展。研究表明[14]慢性炎癥反應(yīng)貫穿整個(gè)AS病理過程，而LDL是慢性炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和維持的基本要素。HDL能將外周血管壁內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟分解代謝，即膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，因此減少膽固醇沉積于血管壁，抑制脂質(zhì)斑塊形成，從而起到抗AS的作用[15]。已有大量證據(jù)表明提高血漿HDL，降低血漿TC、LDL-C可逆轉(zhuǎn)AS 的發(fā)生[16]。故改善脂質(zhì)代謝紊亂是防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要措施。

血管內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，正常的動(dòng)脈壁由腔面至外依次分為內(nèi)膜、中膜和外膜三層。AS主要病理基礎(chǔ)是血管內(nèi)膜增厚，其特征性表現(xiàn)為局部的粥樣斑塊性增生。通過內(nèi)膜厚度的比較在一定程度上反映各組大鼠胸主動(dòng)脈動(dòng)脈粥硬化程度的不同。

蛭龍活血通淤膠囊目前廣泛應(yīng)用于臨床AS 的治療?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)黃芪能明顯清除氧自由基、改善微循環(huán)、抑制血小板黏附聚集，減少血栓形成，調(diào)節(jié)血脂，減少AS 的發(fā)生[17]；地龍具有抑制血小板聚集、促進(jìn)血液流動(dòng)、防止血栓形成和降血脂作用[18]；水蛭有降血脂和改善血液流變學(xué)作用[19]；桂枝也有抗血小板聚集、促進(jìn)血液循環(huán)及明顯的降血脂作用[20]；大血藤有抗炎、抗自由基、抑制血小板聚集等作用[21]。本研究結(jié)果顯示，除拆6 號(hào)及7 號(hào)組外，與模型組相比余各藥物組均能降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C含量，能不同程度的影響大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變，保護(hù)血管內(nèi)皮損傷，其中以蛭龍活血通瘀膠囊全方組和阿托伐他汀組效果最佳，這說明蛭龍活血通瘀膠囊能通過改善脂質(zhì)代謝紊亂和保護(hù)大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變而影響AS的發(fā)生發(fā)展。且在不考慮藥物相互作用的情況下，黃芪、桂枝、水蛭、地龍?jiān)隍锡埢钛瞿z囊抗AS效應(yīng)中發(fā)揮主要作用，而大血藤在其中作用不明顯。

4 結(jié)論

蛭龍活血通瘀膠囊全方及有效拆方組對大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)都有不同程度保護(hù)作用，能降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，改善脂質(zhì)代謝，從而表現(xiàn)出抗AS效應(yīng)。其中黃芪、地龍、桂枝、水蛭起主要抗AS作用，黃芪是核心藥味，若不考慮藥物間相互作用影響，大血藤可能無抗AS作用。