付 娟，姜朝麗，王天剛，趙 龍，晉小寧，李 志

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，四川瀘州 646000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是消化系統(tǒng)常見的急腹癥之一，盡管大多數AP 具有自限性，但仍有20%～30%可發(fā)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），其并發(fā)癥多、病情兇險，院內病死率高達15%[1]。SAP不僅引起胰腺局部的炎癥反應，也常引起胰腺以外多器官損傷，肝臟為主要損傷器官之一，肝衰竭是SAP 患者死亡的主要影響因素之一，發(fā)生率高達83%[2]。目前重癥急性胰腺炎肝損傷的發(fā)病機制尚未完全闡明，有關研究表明氧化應激反應為關鍵的發(fā)病機制[3-6]，因此早期阻斷或抑制氧化應激對防治SAP 合并肝損傷，保護肝功能至關重要。本研究通過觀察柴黃清胰活血方對SAP 模型大鼠血清淀粉酶（AMY）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）的影響，對比用藥后超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、血紅素加氧酶-1（HO-1）等氧化應激水平的變化，探討柴黃清胰活血方對SAP 模型大鼠肝臟損傷的保護作用及可能機制，以期為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠128只，體重（250±30）g，8 周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（川）2015-030）]。動物實驗通過西南醫(yī)科大學倫理委員會批準（審批號:2020885）。

1.2 實驗藥物及試劑

柴黃清胰活血方成藥由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，通過相關工藝制成流浸膏，流浸膏生藥含量為2.02 g/g（批號:20180602），本次實驗用量為1.2 g/kg。?；悄懰徕c（sigma，批號：#SLBT9650）；戊巴比妥鈉（天津蘭洪新能源科技公司，批號：170108）；HE 染色試劑盒（Solarbio，批號：20191015）；MDA、T-SOD、GSH-PX、CAT、ALT、AST 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A003-1-2，A001-1-2，A005-1-2，A007-1-1，C009-2-1，C010-2-1）；山羊抗鼠IgG（Bioss，批號：AG05187292）；山羊抗兔IgG、HO-1抗體（購自CST，批號：27、1#$UNIVPA19-07003308_25）；總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，批號：#S7801）等；Real-time PCR引物由成都擎科生物有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

1.3 動物模型制備、分組及給藥

適應性喂養(yǎng)1 周后SD 大鼠隨機分為4 組（n1=32），即Blank、Sham、SAP 和Chaihuang 組；各組再分6 h、12 h、24 h、48 h 4 個亞組（n=8）。于實驗前12 h開始禁食，但不禁水，稱重后，以1%戊巴比妥鈉（6 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，再固定，剃毛備皮，消毒，鋪巾，沿腹中線于劍突下剪一長2～3 cm切口，逐層入腹，找到十二指腸和胰腺，在近肝門處用小動脈夾閉暫時性阻斷胰膽管，清潔磨鈍尾靜脈針頭沿十二指腸乳頭對側腸壁無血管區(qū)緩慢進入胰膽管約0.5 cm，0.1 mL/min 緩慢勻速推注5%?；悄懰徕c（1 mL/kg BW），拔針后壓迫穿刺點5 min，當胰腺組織開始腫脹并初步呈現充血、點狀出血征象時，初步判斷模型制備成功，觀察造模成功后，松開動脈夾并逐層縫合關腹。Sham 組開腹后僅翻動胰腺和十二指腸即逐層縫合關腹，Blank 組不予任何干預。術后背部皮下注射4 mL 生理鹽水補充術中失水，術后自由飲水，注意保暖。麻醉蘇醒后，Chaihuang 組灌胃柴黃清胰活血方流浸膏藥液（1.2 g/kg），Sham組和SAP組灌胃給予生理鹽水（10 mL/kg），均隔6 h給藥1次。

1.4 標本采集和指標檢測

術后6、12、24、48 h 分批取材各組8 只大鼠，取材時沿原切口剪開腹腔，觀察大鼠腹腔、胰腺、肝組織的大體形態(tài)變化。腹主動脈取血，靜置后離心-20 ℃保存以備生化檢測；10%甲醛固定部分新鮮肝臟組織備測病理檢查（參Camarg法進行雙盲病理評分）；余下部分制備勻漿凍存于-80 ℃冰箱備測Western Blot、RT-PCR，各項指標均按試劑盒說明書嚴格操作。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗數據使用prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以均數±標準差（x±SD）表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重癥急性胰腺炎模型大鼠制備后胰腺及腹腔觀察

大鼠胰腺呈不同程度的充血、水腫，部分可見出血、壞死和脂肪皂化斑；HE 染色可見葉間隙腺泡間隙明顯擴張，部分腺泡壞死，壞死灶內有大量炎細胞浸潤；腹腔可見淡黃色或血性渾濁腹水，腸管顏色變暗，管壁充血水腫明顯，腸腔內積聚大量糞便和液體，腹腔臟器呈不同程度粘連，表明重癥急性胰腺炎大鼠模型制備成功，見圖1。

圖1 大鼠胰腺組織形態(tài)結構（HE染色，× 200）

2.2 HE染色肝組織的光鏡下觀察及病理學評分

Blank組和Sham組肝細胞形態(tài)正常，排列整齊，未見細胞凋亡、壞死及炎細胞浸潤等改變，兩組對比無明顯差異。SAP組6 h肝細胞水腫，空泡形成，少許紅細胞堆積和炎細胞浸潤；12 h肝索排列紊亂，點狀細胞壞死，炎細胞浸潤增加；24 h 肝血竇擴張，組織間紅細胞充盈，見較多細胞嗜酸性變，壞死面積增大；48 h 肝細胞水腫較24 h 稍減輕，肝索排列紊亂，仍見炎細胞浸潤。Chaihuang 組較同時間點SAP 組，肝細胞損傷明顯減輕，小葉結構尚存，炎性浸潤和細胞嗜酸性變少見，未見明顯肝細胞壞死，見圖2。Sham 組與Blank 組比較，肝臟組織病理評分差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；SAP組、Chaihuang組較Sham組病理評分明顯升高（P＜0.05）；Chaihuang 組病理評分較SAP組降低（P＜0.05），見表2。

圖2 各組大鼠肝組織形態(tài)結構（HE染色，× 200）

表2 各組大鼠肝組織病理學評分（x±SD，n=8）

2.3 大鼠血清AMY、ALT、AST比較

與Blank 組相比，Sham 組血清AMY、ALT、AST水平無明顯差異（P ＞0.05）。與Sham組相比，SAP組和Chaihuang 組各時點AMY、ALT、AST 含量均明顯升高（P＜0.05）。與SAP組相比，Chaihuang組各時點AMY、ALT 含量均顯著降低（P＜0.05）；12、24、48 h AST 水平明顯降低（P＜0.05），6 h AST 水平無明顯差異（P ＞0.05），見圖3～圖5。

圖3 各組大鼠AMY比較

圖4 各組大鼠ALT比較

圖5 各組大鼠AST比較

2.4 大鼠肝組織S〇D、CAT、GSH-Px、MDA比較

與Blank 組相比，Sham 組SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平未見明顯差異（P ＞0.05）。與Sham組相比，6、12、24 h SAP 和12 h Chaihuang 組SOD 水平降低（P＜0.05）；各時點SAP 組和Chaihuang 組CAT、GSH-Px 水平均明顯降低（P＜0.05）；12、24、48 h SAP 組MDA 水平明顯升高（P＜0.05）。與SAP 組相比，Chaihuang 組各時點CAT 水平較高（P＜0.05）；12、24、48 h Chaihuang 組GSH-Px 水平升高（P＜0.05）；12、24、48 h Chaihuang 組MDA 水平降低（P＜0.05），見圖6～圖9。

圖7 各組大鼠肝組織CAT比較

圖8 各組大鼠肝組織GSH-Px比較

圖9 各組大鼠肝組織MDA比較

2.5 大鼠肝組織H〇-1 mRNA表達比較

與Blank組相比，Sham組HO-1 mRNA表達水平無明顯差異（P ＞0.05）。SAP 和Chaihuang 組各時間點較Sham 組HO-1 mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.05）。12、24、48 h Chaihuang組HO-1 mRNA水平較SAP組更高（P＜0.05），見圖10。

圖10 各組大鼠肝組織H〇-1 mRNA比較

2.6 大鼠肝組織H〇-1蛋白表達比較

與Blank組相比，Sham組HO-1蛋白表達無明顯差異（P ＞0.05）；6、12、24 h SAP 組和Chaihuang 組HO-1 水平較Sham 組明顯升高（P＜0.05）。Chai?huang 組6、12、24 h HO-1 蛋白表達較SAP 組更高（P＜0.05），見圖11。

圖11 各組大鼠肝組織H〇-1蛋白比較

3 討論

SAP 為臨床危急重癥，極易合并多器官功能損害，以肝臟為主要損傷器官，且與病情程度呈正相關[2]。SAP 合并肝功能損害較為復雜，ALT、AST 是急性肝細胞損傷的敏感標志，廣泛運用于肝功能及SAP 肝損傷評價[7-8]。本實驗結果顯示，模型組和柴黃組ALT、AST活性明顯高于假手術組，柴黃組總體水平低于模型組，結合AMY 含量的改變，提示造模后大鼠確有不同程度的肝功能受損，而柴黃清胰活血方對SAP模型大鼠肝損傷有保護作用。

氧化應激被認為是AP發(fā)病機制的重要調節(jié)器，是指機體受各種因素刺激造成氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，導致組織損傷，干擾器官正常代謝活動的一種應激狀態(tài)[9]。在SAP病程進展過程中胰腺腺泡細胞受損產生大量的氧自由基，過量的氧自由基可視為重要的炎性介質加重胰腺局部的炎癥反應，且可增加毛細血管通透性，損傷血管內皮細胞，釋放大量有毒物質引起扳機樣級聯(lián)放大連鎖反應，導致胰腺及胰外多臟器損傷等改變，尤其是肝臟。有研究[10]表明脂質過氧化的加重和抗氧化水平的下降加重了AP模型大鼠的肝損傷，評價氧化應激反應可通過檢測氧化應激中間產物，如MDA可反映機體脂質過氧化和細胞受自由基攻擊的損傷程度；亦或檢測體內抗氧化酶，如SOD、CAT、GSH-Px等可間接反映機體清除活性氧的能力。本實驗研究制備SAP 大鼠模型后，病理結果顯示模型大鼠存在明顯肝損傷，其肝索排列紊亂，伴不同程度的細胞嗜酸性變、肝細胞壞死亦或炎性細胞浸潤；肝組織SOD、CAT、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，表明肝損傷進程存在明顯的氧化應激失平衡改變。而柴黃組SOD、GSH-Px、CAT 水平明顯高于模型組，MDA 活性低于模型組，提示柴黃清胰活血方可恢復肝組織氧化和抗氧化平衡，增強抗氧化、減弱過氧化以保護SAP并發(fā)肝損傷。

HO-1是血紅素降解的限速酶，能夠在代謝過程中發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗增殖的作用，已成為一種重要的防御分子[11]。Zhang 等[12]實驗證明HO-1通過抗炎和抗氧化機制減少脂質過氧化，防止細胞凋亡或衰竭，降低胰腺和肝臟損傷相關標志物的表達，尤其在減輕炎癥反應，保護胰腺和肝臟等器官免受損傷方面發(fā)揮重要作用。本實驗通過測定SAP 模型大鼠肝組織HO-1 蛋白和mRNA 的表達，結果表明柴黃組和模型組較假手術組數值升高，結合組織病理學結果提示HO-1 參與SAP 并發(fā)肝損傷過程，證實了HO-1 是一種細胞保護酶，在炎癥等應激狀態(tài)下可啟動機體適應性（代償性）保護機制[11-12]；而柴黃組HO-1 水平較模型組更高，提示柴黃清胰活血方可通過誘導HO-1表達的上調對SAP模型大鼠肝損傷起到保護作用。

祖國醫(yī)學認為SAP多因酒食不節(jié)、情志失舒、外邪侵襲、蟲積內擾等導致濕、熱、瘀、毒結聚中焦，脾胃升降傳導失司，肝膽氣機疏泄不利，氣滯血瘀，甚至血敗肉腐，陰陽離絕。柴黃清胰活血方由生大黃、柴胡、黃芩等14味中藥組成，具有清熱解毒、通腑泄?jié)?、疏肝利膽、活血化瘀、緩急止痛之功。現代藥理學研究證實，大黃具有抗炎、改善微循環(huán)、清除內毒素、促進腸蠕動等藥理活性，能有效減輕膽汁及胰液淤積，降低SAP大鼠血清ALT、AST，減輕SAP并發(fā)肝損傷[13]。黃芩的主要成分為黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等作用，可下調SAP 患者NF-κB 活性和炎癥因子IL-6 水平，使AMY、ALT 下降，減輕胰腺、肝臟組織損傷[4，8]。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷可調控NF-κB/STAT3 信號通路，發(fā)揮抗菌、抗炎、增強免疫、解熱、鎮(zhèn)痛的作用，減輕小鼠肝損傷程度[14]；且可提高GSH 等抗氧化水平，降低MDA活性及其引起的交聯(lián)性損傷[15]。

4 結論

SAP 并發(fā)肝損傷是一個多因素、多方面且復雜的病理生理過程。本課題組前期實驗研究中已證實柴黃清胰活血方對SAP模型大鼠具有治療作用[16-18]，本研究進一步探討其對肝損傷氧化應激作用機理，結果顯示給予柴黃清胰活血方干預可通過誘導HO-1 表達的上調抑制氧化應激反應（降低MDA 水平），有效提高機體對氧自由基的清除能力（升高SOD、CAT、GSH-Px 活性），從而降低肝損傷相關標志物（ALT、AST）的表達，減輕SAP 模型大鼠肝臟組織病理損傷程度。但本方藥味的藥理及化學成分復雜，難以解釋發(fā)揮療效的可能靶點和信號通路，今后可根據中藥多途徑、多靶點的作用特點，借助網絡藥理學分析和闡釋組方藥對關系及作用機制，并進行深入臨床研究，以更好地掌握SAP 并發(fā)肝損傷的發(fā)病機制，為該病的防治和新藥的研究提供新的理論和實踐依據。