韓 梅，楊思進，江 燕，劉孟楠

（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科，四川瀘州 646000）

以頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）為特征的頸內(nèi)動脈血管壁內(nèi)的變化可導致斑塊易損，進而引發(fā)頸動脈相關性腦血管缺血性事件的發(fā)生，簡稱動脈粥樣硬化性腦梗死（atherosclerotic cere?bral infarction，ACI）[1]。其高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率仍是導致世界人口死亡的主要原因之一[2]。因此，早發(fā)現(xiàn)和早治療頸動脈粥樣硬化，維持頸內(nèi)動脈斑塊穩(wěn)定，可減少ACI的發(fā)生。蛭龍活血通瘀膠囊為本院楊思進教授研制而成的純中藥院內(nèi)制劑（專利號：200810147774.1）。前期研究已證實，該中藥復方制劑對缺血性中風及相關疾病的防治具有顯著療效，其作用機制可能與降低血脂、抑制炎性反應等有關[3-4]。本研究擬通過觀察蛭龍活血通瘀膠囊對頸動脈粥樣硬化實驗兔血脂水平以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達作用，以揭示蛭龍活血通瘀膠囊對CAS 的干預作用及對ACI的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌雄各半新西蘭大白兔50 只，體重（2.0±0.4）kg，清潔級，半月齡。由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號SYXK（川）2018-065。

1.2 實驗藥物

蛭龍活血通瘀膠囊是由黃芪、水蛭、地龍、桂枝、大血藤等中藥研制而成的純中藥復方膠囊制劑，0.4 g×36粒/瓶，由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供（批準文號：川藥字Z20070528）；阿托伐他汀鈣片（阿樂），規(guī)格20 mg∕片，由北京嘉林藥業(yè)股份有限公司提供（國藥準字H20093819）；速眠新Ⅱ注射液（鹽酸賽拉嗪注射液），由敦化市圣達動物藥品有限公司提供（批準文號：獸藥字（2010）070031582）；硫酸慶大霉素注射液，由華中藥業(yè)股份有限公司提供（批準文號：國藥準字H42021503）。

1.3 試劑、儀器與飼料

兔實驗所需試劑盒均購買于上海碧云天生物技術有限公司。全自動生化儀（貝克曼庫爾特公司），Western Blotting 系統(tǒng)（Bio-Rad 公司），Tanon 6600 發(fā)光成像工作站（Tanon公司）等。高脂飼料由普通飼料96%、膽固醇2%、豬油2%配制而成[5]，由成都達碩實驗動物有限公司提供[許可證編號SCXK（川）2014-028]。

1.4 分組、造模與給藥

將50只新西蘭大白兔適應性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法隨機分為5 組，即正常對照組（Control）、模型組（Model）、蛭龍活血通瘀膠囊組（ZL）、阿托伐他汀鈣片組（Atorvastatin）、蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀鈣片混合用藥組（ZL+Atorvastatin），每組各10只。除正常組普通飼料喂養(yǎng)外，其余四組均采用高脂飼料喂養(yǎng)1周后依托經(jīng)典頸動脈內(nèi)膜空氣干燥術加速造模。

術前12 h 禁食不禁水，通過肌肉注射速眠新注射液（1.5 mL/kg）麻醉實驗兔，待麻醉完全后，將實驗兔固定于手術臺上，頸部備皮后消毒，沿頸部中線作縱行切口，于甲狀軟骨上方水平逐層鈍性分離，暴露右側(cè)頸總動脈，小心分離出約2 cm 長的頸總動脈段，并用微血管夾夾住血管兩端以阻斷血流。然后用4.5號頭皮針從阻斷的頸動脈近心端穿刺入血管，并于該段頸總動脈遠心端穿刺形成一個小孔，以便空氣可以通過該孔逸出。將鹽水注入血管中，以沖洗掉殘留在動脈管腔中的血液。然后用無菌醫(yī)用氮氣以120 mL/min的恒定速率流經(jīng)動脈，共10 min。停止輸氣后將準備好的生理鹽水引入動脈，以清除管腔殘留的空氣。取下微血管夾恢復管腔血流，用無菌棉簽輕輕按壓穿刺部位止血，約10 min?？偛僮鲿r間約為30 min?？p合皮膚傷口，將動物分開飼養(yǎng)。

所有實驗程序均按照《中國實驗動物管理條例》的規(guī)定和一般建議進行，并盡一切努力使所用動物遭受的痛苦最小化。術后肌肉注射慶大霉素（5 mg/kg/d，持續(xù)3 d），以預防感染的發(fā)生，術后繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)1 周開始給藥[6-7]。蛭龍活血通瘀膠囊組予以蛭龍活血通瘀膠囊3.12 g 生藥/kg/d 灌胃（成人用量為4.8 g/d，體重按60 kg計算，換算為動物高劑量，為成人用量6 倍[8]，因膠囊劑不便于實驗兔服用，故本實驗按生藥給藥）。阿托伐他汀鈣片組予以阿托伐他汀鈣片0.51 mg∕kg∕d灌胃（按臨床20 mg∕d折算，兔等效劑量為臨床成人用量的3倍[8]。因片劑不便于實驗兔服用，故本實驗研磨成粉狀給藥）?；旌嫌盟幗M予以3.12 g 生藥/kg/d+0.51 mg/kg/d 灌胃給藥，在整個實驗過程中，正常組和模型組不進行藥物干預，每組每只都配合予以等量4 mL∕kg生理鹽水灌胃給藥。所有實驗兔每日每只進食飼料150 g，單籠喂飼，飲水不限。所有實驗兔于給藥4 周末分別采取血清及頸動脈標本進行相關指標檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 血脂測定 各組實驗動物于給藥4 周末清晨空腹心臟穿刺采血，靜置離心取血清，使用全自動生化分析儀分別測定血清中總膽固醇（total cholester?ol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholester?ol，HDL-C）的濃度。

1.5.2 頸動脈組織病理觀察 于實驗給藥4 周末留取血標本后以空氣栓塞法處死動物后收集頸動脈組織標本，取材時，大體觀察各血管節(jié)段病變情況后，盡可能長的剪取局部頸總動脈，取上半部分放入預先備好的4%多聚甲醛溶液中4 ℃過夜固定并石蠟包埋，采用HE 染色制作成病理切片，分別在× 100和×400 普通光學顯微鏡下觀察頸動脈組織病理學改變。下半部分頸總動脈迅速裝入干凈無菌的凍存管并立即放入液氮保存，用以Western Blot檢測。

1.5.3 Western Blot 法檢測頸動脈組織中MMP-2、MMP-9的蛋白表達情況 取頸動脈組織，每100 mg加入預冷組織裂解液1 mL，勻漿機進行勻漿后離心取上清液，嚴格按照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測蛋白濃度。充分混合的上清加5×loading buffer后于沸水中煮沸變性10 min，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒆冃院玫慕M織樣品冰上溶解后開始上樣（根據(jù)計算好的蛋白定量，用移液槍上樣，預染蛋白Maker和樣品）。SDS-PAGE 電泳后使用半干法轉(zhuǎn)膜至PDVF膜，用5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床上搖動封閉1 h，洗去封閉液，洗膜2 次，每次5 min。分別加已稀釋一抗MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，回收已稀釋的一抗，用TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入稀釋好的二抗常溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。將PVDF 膜倒扣在100 μL A 液和100 μL B 液混合化學發(fā)光試劑中約5 min 后，便可在Tanon 6600 發(fā)光成像工作站進行信號檢測，保存好掃描文件，用Image Pro Plus 6.0 分析軟件計算分析所保存圖片上的每個特異性條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 8.0.1 軟件統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準差（）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way AN0VA），兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗兔給藥后血脂水平比較

實驗給藥4 周末穿刺心臟采集血清標本，每組各隨機選取7 例標本進行血脂檢測。如表1 所示：與Control 相比，Model 組血脂水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明CAS 模型建立成功；各用藥組實驗兔經(jīng)藥物干預后，血脂水平均有不同程度降低，與Model組相比，各用藥組HDL-C未見明顯差異。

表1 各組實驗兔血清中TG、TCH〇L、HDLC、LDLC水平（，n=7）

表1 各組實驗兔血清中TG、TCH〇L、HDLC、LDLC水平（，n=7）

注：與Control組相比，aP＜0.05；與Model組相比，bP＜0.05

2.2 各組實驗兔頸動脈病理切片圖

實驗給藥4 周末處死所有動物，分別采集各組頸動脈標本制作病理切片，在普通光學顯微鏡（×100和×400）下觀察各組病理學改變，結(jié)果如圖1：正常組實驗兔頸動脈內(nèi)膜光滑完整，管壁各層結(jié)構清晰，未見炎性細胞浸潤及頸動脈粥樣硬化斑塊形成。模型組與正常對照組比較，模型組兔頸動脈內(nèi)膜增生嚴重，管腔內(nèi)可見明顯的斑塊形成，斑塊內(nèi)可見薄層的纖維帽及脂質(zhì)核心，大量泡沫細胞聚集，中外膜不規(guī)則增厚，符合CAS病理學改變。蛭龍活血通瘀膠囊治療組及阿托伐他汀治療組與模型組相比，內(nèi)膜增厚程度明顯減輕，少量薄斑塊，且斑塊內(nèi)泡沫細胞明顯減少；蛭龍活血通瘀膠囊和阿托伐他汀鈣片聯(lián)合用藥組可見內(nèi)皮細胞形態(tài)尚完整，部分炎性細胞浸潤，未見明顯泡沫細胞沉積及斑塊形成，與模型組相比病理改善程度較明顯，且優(yōu)于單藥物組。

圖1 各組實驗兔頸動脈標本HE染色（x 100，x 400）

2.3 各組實驗兔給藥后頸動脈組織中MMP-2、MMP-9 含量比較

每組各隨機選取3 例頸動脈組織標本，采用Western Blot 法分別測定各組標本中MMP-2 和MMP-9的蛋白表達情況。結(jié)果如表2所示：與正常組相比，模型組MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)蛭龍活血通瘀膠囊或阿托伐他汀鈣片單獨干預后，與模型組相比，MMP-2 蛋白水平有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MMP-9 蛋白水平在蛭龍活血通瘀膠囊組顯著降低（P＜0.05），而在阿托伐他汀鈣片組無顯著變化；但當中西藥物組聯(lián)合干預后，上述兩種蛋白變化趨勢均較單藥物組更為明顯。

表2 各組實驗兔Foxp3、MMP-2、MMP-9蛋白情況（，n=3）

表2 各組實驗兔Foxp3、MMP-2、MMP-9蛋白情況（，n=3）

注：與Control組相比，aP＜0.05；與Model組相比，bP＜0.05

圖2 各組實驗兔頸動脈組織相關蛋白含量表達

3 討論

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈硬化中最常見的血管疾病，因其動脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣而得名[9]。頸動脈粥樣硬化（carotid ath?erosclerosis，CAS）是動脈粥樣硬化在頸動脈的表現(xiàn)，被稱為全身動脈粥樣硬化的觀察“窗口”[10]。大量研究表明，動脈粥樣硬化是由低密度脂蛋白在動脈血管管壁中積累引起的炎性疾病，炎癥的激活在動脈粥樣硬化的發(fā)病機理中起著重要作用，并貫穿始終[11]。人體內(nèi)炎癥反應的增強不僅有助于動脈粥樣斑塊的形成，而且在動脈斑塊失穩(wěn)中起著至關重要的作用，是將慢性動脈粥樣硬化性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙匝ㄋㄈ约膊〉年P鍵因素[12]。血脂異常是動脈粥樣硬化的基本危險因素[13]，相關脂質(zhì)譜（即TC，TG，HDL-C，LDL-C）與頸動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展具有顯著關系[14]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭大白兔在進食高脂飼料后，易形成高膽固醇血癥，并在上述基礎上產(chǎn)生自發(fā)性病變，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，已被廣泛用于動脈粥樣硬化研究的動物模型制備[5，15]?？諝飧稍镄g這種利用干燥的氣流直接風吹血管內(nèi)膜的方法，易造成內(nèi)膜增生明顯，血管狹窄程度加重，且內(nèi)皮細胞的修復與內(nèi)膜的增殖過程更接近頸動脈疾病的生理過程，穩(wěn)定性好[6-7]。為了盡快促成動脈粥樣硬化模型的形成，本實驗采用高脂飼料飲食和頸動脈內(nèi)膜空氣干燥術相結(jié)合的方法制備CAS 模型?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是蛋白水解酶的一個大家族，已被證明在形態(tài)發(fā)生，傷口愈合，組織修復和重塑中起重要作用[16]。駐留在血管壁和動脈粥樣硬化斑塊中的血管細胞尤其是泡沫細胞及巨噬細胞是蛋白酶的豐富來源，并不斷在不穩(wěn)定斑塊中聚集，從而引起血管細胞外基質(zhì)的降解，破壞動脈粥樣硬化斑塊纖維帽，增加斑塊不穩(wěn)定性甚至導致斑塊破裂[17]。明膠酶（MMP-2，MMP-9）是MMPs亞家族成員，可有效裂解變性的膠原蛋白及溶血素，具有廣泛的特異性，在調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的遷移和增殖中以及在纖維帽的維持上起著重要作用[18]。研究表明，動脈粥樣硬化斑塊中大量促炎分子反應的增強，可導致MMP-2、MMP-9表達活性的增加，在許多經(jīng)過測試的MMPs 中，MMP-2、MMP-9 的蛋白水平和活性與發(fā)生高危頸內(nèi)動脈狹窄及其腦血管事件密切相關[19]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組較正常組各組血脂水平均顯著升高，病理觀察可見典型的動脈粥樣硬化斑塊及泡沫細胞浸潤，MMP-2 和MMP-9 相關蛋白的表達活性均顯著增加，說明炎癥反應參與了CAS的形成，建造動脈粥樣硬化模型成功；經(jīng)各藥物組干預后，各組血脂水平均有不同程度改善，泡沫細胞及炎性細胞聚集減少，MMP-2 與MMP-9 相關蛋白的表達活性都有不同程度下降，其中中西混合藥物組干預后變化更為顯著，且未見明顯斑塊形成。說明蛭龍活血通瘀膠囊及阿托伐他汀鈣片可在一定程度上通過改善血脂、減輕局部血管炎性反應，抑制或減少相關基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，穩(wěn)定易損斑塊，從而起到對CAS的保護作用。

頸動脈粥樣硬化屬于現(xiàn)代醫(yī)學的病理學病名，中醫(yī)學中并沒有以頸動脈粥樣硬化命名疾病的記載，因其病位在血管脈絡，所以可將其納入“脈痹”的范疇。頸動脈粥樣硬化性疾病臨床常見的證型以虛為主，實證則以痰瘀為主，提示本病屬于本虛標實虛實夾雜之癥，其病機核心為“痰瘀互結(jié)，阻滯經(jīng)絡，氣血不通”[20]。因此，在遵循扶正祛邪總的治療原則上，當以益氣活血、滌痰驅(qū)瘀為核心[21]。蛭龍活血通瘀膠囊[22]是本院楊思進教授經(jīng)過30 余年的不斷摸索，在“益氣祛風通絡法”指導下，并創(chuàng)新性引入開通玄府的配伍方法，以“重用補氣，輔以化痰祛瘀通絡，佐以風藥”為配伍原則研制而成的純中藥院內(nèi)制劑。該藥主要由黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等中藥研制而成。方中黃芪以“益氣”為根本，其主要有效成分為黃芪多糖及皂苷類等。藥理研究[23]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖不僅具有降血脂作用，而且能通過相關途徑抑制炎癥免疫反應而起到抗AS作用；黃芪總皂苷和總黃酮能降低全血及血漿黏度、改善血瘀型大鼠血液流變指數(shù)，增加動脈血流量而起到防治AS 作用[24]。尉希清等[25]通過體內(nèi)及體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷通過下調(diào)PDGF-BB 的表達，減少平滑肌細胞增殖、遷移，防止內(nèi)膜過度增生，從而起到對動脈血管的保護作用。水蛭中的活性物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)和多肽類大分子，諸多的基礎和臨床研究發(fā)現(xiàn)，其提取物及相關復方制劑均表現(xiàn)出具有抑制脂質(zhì)浸潤、保護血管內(nèi)皮、抑制炎癥反應等多作用功效，能多靶點影響動脈粥樣硬化進程[26]。地龍性味寒、咸歸腎、肺、肝經(jīng)，能通經(jīng)活絡、平肝熄風，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)地龍及其有效成分具有抗炎鎮(zhèn)痛、降脂、抑制血小板聚集等作用，能有效改善腦卒中患者的血管功能[27-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，以上3味藥物配伍使用具有明顯的抗體內(nèi)血栓形成作用，通過某一途徑增加血漿NO 含量，并且能通過降低MDA水平，從而減輕自由基對缺血性腦組織的損傷[29]。大血藤化學成分多樣，藥理作用廣泛，據(jù)古籍記載，其有“行血，治氣塊”之功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，大血藤提取物具有抑制相關炎癥反應，改善心肌缺血，提高各組織器官的血流灌注量，并能降低組織粘連等功效[30]。組方中桂枝能通陽化氣，即溫通心陽，推動血行的作用，常被稱為治心病之要藥，現(xiàn)代藥理研究亦表明，桂枝具有明顯降脂、解熱鎮(zhèn)痛、抗凝血、清除自由基、抗氧化減少組織缺血再灌注損傷等作用[31]。同時，“玄府為絡脈之門戶”，“玄府郁閉為百病之根”，“離經(jīng)之血皆為瘀血”。本病屬本虛標實虛實夾雜之癥，實證中心環(huán)節(jié)是“瘀阻”“閉塞”。方中地龍、大血藤、桂枝配伍為其“治血先治風，風去血自通”提供了理論依據(jù)。由此可見，蛭龍活血通瘀膠囊組方原則在遵循中醫(yī)學整體觀念基礎上，統(tǒng)籌兼顧、標本兼治。共同發(fā)揮出鼓舞陽氣、益氣祛風、通絡開玄、暢達三焦的作用。從而起到穩(wěn)定易損斑塊，防治動脈粥樣硬化的功效。

4 結(jié)論

本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)加頸動脈內(nèi)膜空氣干燥術的方法構建兔頸動脈粥樣硬化模型。分別觀察蛭龍活血通瘀膠囊、阿托伐他汀鈣片及蛭龍活血通瘀膠囊和阿托伐他汀鈣片混合用藥對實驗兔血脂的影響及相關病理改變，并通過對相關基質(zhì)金屬蛋白酶的觀察，蛭龍活血通瘀膠囊可在一定程度上改善頸動脈粥樣硬化血脂水平，抑制或減輕MMP-2、MMP-9 的表達，穩(wěn)定易損斑塊，從而起到保護頸動脈粥樣硬化的作用，有較高的臨床應用及推廣價值。