黃玉平，曾貴俊，楊 瑤，趙 勇

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500 )

霸王鞭(Euphorbiaroyleana)為大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬(Euphorbia)植物，主要分布于中國(guó)的西南地區(qū)、印度北部及巴基斯坦[1].全株及乳汁入藥，具有祛風(fēng)、消炎、解毒之功效[2].前人研究發(fā)現(xiàn)，該植物中的二萜具有NO抑制活性和抗血管生成的活性[2-3]，且霸王鞭的提取方法不同，對(duì)腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)顯示出不同的功效[4]；小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其乙酸乙酯提取部位具有良好的鎮(zhèn)痛﹑退熱﹑抗炎﹑抑制免疫力的活性，而正己烷提取部位具有抗腫瘤活性[5-6].為了發(fā)現(xiàn)活性化學(xué)成分，作者對(duì)采自西雙版納的霸王鞭地上部分的正丁醇提取物進(jìn)行了分離純化，得到7個(gè)單體化合物(見(jiàn)圖1)，分別鑒定為4′-甲氧基槲皮素(1)、taxifolin(2)、咖啡酸(3)、1，2，4-苯三酚(4)、尿囊素(5)、尿嘧啶(6)和肌醇(7).所有的化合物均首次從該植物中分離得到.

圖1 化合物1～7結(jié)構(gòu)圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

核磁共振儀：DRX-500、DRX-600 (瑞士Bruker公司)；質(zhì)譜儀：Finnigan-MAT-95-MS (德國(guó)Finnigan公司)；半制備高效液相色譜儀：Agilent 1260型，色譜柱：Agilent ZoRBAX SB-C18(美國(guó)安捷倫公司，9.4 mm×25 cm)，DAD檢測(cè)器；紫外分光光度儀：Shimadzu UV2401PC；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELAN-1100 (日本東京理化有限公司)；真空泵：SHZ-D(Ⅲ)(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；電子天平：PL202-S (梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；陶瓷封閉式恒溫電爐：HP-05 (上海學(xué)森儀器有限公司)；其他各種規(guī)格普通玻璃柱 (北京欣維玻儀器有限公司)；100～200、200～300目硅膠(青島譜科分離材料有限公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia公司)；反相硅膠RP-18(Merck公司)；其它所用溶劑均由昆明福海達(dá)有限公司提供.

該植物于2009年9月采自云南省西雙版納，經(jīng)西雙版納植物園張順成老師鑒定為霸王鞭(Euphorbiaroyleana)，標(biāo)本保存于云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院(No. ZSC0903).

1.2 提取與分離

將干燥的霸王鞭地上部分 6 kg 粉碎后，用70%丙酮浸泡3次，每次浸泡 3 d.將浸泡所得溶液經(jīng)減壓蒸餾得到浸膏，浸膏用水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取(各萃取3次).溶劑經(jīng)減壓蒸餾后得到石油醚部分(94 g)，乙酸乙酯部分(87 g)，正丁醇部分(57 g).正丁醇部分經(jīng)硅膠柱層析分離、洗脫(體積比,氯仿∶甲醇 =10∶1～1∶1)，得到10個(gè)組分(Fr.1～Fr.10).組分Fr.1(200 mg)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠脫色洗脫(體積比，氯仿∶甲醇=1∶1)，正相硅膠分離(體積比，氯仿∶甲醇=10∶1～8∶1)，最后經(jīng)半制備HPLC(體積分?jǐn)?shù)為30% CH3OH-H2O)得到化合物6(tR= 2.4 min,13.1 mg).組分Fr.6(4g)經(jīng)Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠洗脫(體積比，氯仿∶甲醇=12∶1～2∶1)得到3個(gè)組分(Fr.6-1～Fr.6-3).組分Fr.6-2正相硅膠分離(20∶1～1∶1)，得到5個(gè)組分(Fr.6-2-1～Fr.6-2-5).組分Fr.6-2-2經(jīng)反相硅膠(RP-18)柱層析洗脫(體積比，甲醇∶水=4∶10)，再經(jīng)半制備HPLC分離(體積分?jǐn)?shù)為35% CH3OH-H2O)得到化合物1(tR= 20.5 min,2.7 mg).組分Fr.6-2-3經(jīng)Sephadex LH -20葡聚糖凝膠(體積比，氯仿∶甲醇= 3∶2)洗脫得到化合物7(125.7 mg).組分Fr.4-2-4(48 mg) 經(jīng)反相硅膠(RP-18)柱層析洗脫(體積比,甲醇∶水= 0∶1～1∶0)，再經(jīng)半制備HPLC分離(體積分?jǐn)?shù)，30% CH3OH-H2O)得到化合物5(tR= 2.5 min,9 mg).組分Fr.6-3經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜(甲醇洗脫)，再經(jīng)半制備HPLC分離洗脫(體積分?jǐn)?shù)，35% CH3OH-H2O)得到化合物2(tR= 17.5 min,10.2 mg).Fr.7組分經(jīng)硅膠柱層析洗脫(體積比，氯仿∶甲醇=6∶1～3∶1)得到2個(gè)組分(Fr.7-1和Fr.7-2)，分別經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(體積比，氯仿∶甲醇=1∶1)，再經(jīng)半制備HPLC分離(體積分?jǐn)?shù)，18% CH3OH-H2O)得到化合物4(tR= 4.8 min,10.3 mg)和3(tR= 11.5 min,3.6 mg).

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1C16H14O6,黃色粉末.1H NMR (600 MHz， DMSO-d6)δH:12.48(1H，s，OH-5)，10.86(1H，s，OH-3)，9.82(s，1H，OH-7)，9.51(1H，s，OH-3′)，7.75(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′)，7.68(1H，dd，J=8.7，1.9 Hz，H-6′)，6.93 (1H，d，J=8.7 Hz，H-5′)，6.48(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，3.16-(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δC：176.0(s，C-4)，164.0(s，C-7)，160.8(s，C-5)，156.3(s，C-9)，148.9(s，C-4′)，147.5 (s，C-3′)，146.7(s，C-2)，136.0(s，C-3)，122.1(s，C-1′)，121.8(d，C-6′)，115.6(d，C-2′)，111.6(d，C-5′)，103.1(s，C-10)，98.3(d，C-6)，93.7(d，C-8)，55.8(s，OCH3).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)對(duì)照一致，故鑒定1的結(jié)構(gòu)為4′-甲氧基槲皮素.

化合物2C15H12O7,褐色油狀物.1H NMR (400 MHz，CD3OD)δH:6.97 (1H，brs，H-2′)，6.84(1H，d，J=8.2 Hz，H-6′)，6.80(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，5.92(1H，s，H -8)，5.89(1H，s，H-6)，4.50(1H，d，J=13.2 Hz，H-2)，3.34(1H，d，J=13.2 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD )δC:198.4(s，C-4)，168.7(s，C-7)，165.3(s，C-5)，164.5(s，C-9)，147.1(s，C-3′)，146.3(s，C-4′)，129.9(s，C-1′)，120.9(d，C-6′)，116.1(d，C-5′)，115.9(d，C-2′)，101.8(s，C-10)，97.3(d，C-6)，96.3(d，C-8)，85.1(d，C-2)，73.7(d，C-3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù)對(duì)照一致,故鑒定2的結(jié)構(gòu)為T(mén)axifolin.

化合物3C9H8O4，淺黃色固體.1H NMR (400 MHz，CD3OD)δH:7.50(1H， d，J=15.8 Hz，H-7)，7.03(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.92(1H，dd，J=8.3 Hz，H-5)，6.77(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.22 (1H，d，J=15.8 Hz，H-8)；13C NMR (100 MHz，CD3OD)δC:171.9(s，C-9)，149.3(s，C-3)，146.8(s，C-7)，146.4(s，C-4)，128.0 (d，C-1)，122.7(d，C-6)，116.5(d，C-5，8)，115.0(d，C-2). 以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)對(duì)照一致,故鑒定3的結(jié)構(gòu)為咖啡酸.

化合物4C6H6O3，白色粉末，易溶于甲醇.1H NMR (400 MHz，CD3OD)δH:7.44(1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，7.42(1H，br s，H-3)，6.79(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δC:151.3(s，C-4)，146.0(s，C-2)，123.9(s，C-1)，117.7(d，C-6)，115.7(d，C-3，5).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)對(duì)照一致,故鑒定4的結(jié)構(gòu)為1，2，4-苯三酚.

化合物5C4H6N4O3,無(wú)色片狀結(jié)晶.1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δH:10.53(1H，s，H-1)，8.05(1H，s，H-3)，6.88(1H，d，J=8.0 Hz，H-4)，5.78(1H，s，H-8)，5.24(2H，d，J=8.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δC:173.6(s，C-5)，157.4(t，C-8)，156.8 (q，C-2)，62.4(d，C-4).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]數(shù)據(jù)對(duì)照一致,故鑒定5的結(jié)構(gòu)為尿囊素.

化合物6C4H4N2O2，無(wú)色片狀結(jié)晶.1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)δH:11.01(1H，s，H-3)，10.81(1H，s，H-1)，7.39(1H，brd，J=7.7 Hz，H-6)，5.45(1H，dd，J=7.7，1.9 Hz，H-5)；13C NMR (125 MHz，DMSO-d6)δC:164.8(s，C-4)，151.9(s，H-2)，142.6(d，C-6)，100.7(d，C-5).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]數(shù)據(jù)對(duì)照一致,故鑒定6的結(jié)構(gòu)為尿嘧啶.

化合物7C6H12O6,無(wú)定性粉末.1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH:4.59(1H，brd，J=3.5 Hz，H-4)，4.54(1H，brd，J=3.9 Hz，H-2，6)，4.50(1H，brd，J=2.1 Hz，H-1)，4.40(1H，brd，J=5.3 Hz，H-3，5)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δC:75.4(d，C-1)，73.0(s，C-2，6)，72.8(s，C-4)，72.0(s，C-3，5).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)對(duì)照一致,故鑒定7的結(jié)構(gòu)為肌醇.

3 結(jié)果與討論

從霸王鞭70%的丙酮提取物正丁醇部分分離鑒定了7個(gè)單體化合物，分別鑒定為：4′-甲氧基槲皮素(1)、taxifolin(2)、咖啡酸(3)、1,2,4-苯三酚(4)、尿囊素(5)、尿嘧啶(6)、肌醇(7).所有化合物均首次從該植物中分離得到.其中，化合物1可通過(guò)干擾人肝癌細(xì)胞LM3的增殖和細(xì)胞周期分布誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且通過(guò)抑制LM3 細(xì)胞的遷移和侵襲促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬[14].化合物3對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎具有一定保護(hù)作用[15]；化合物5對(duì)土壤微生物有激活作用和增產(chǎn)雙重效果,對(duì)微生物的激活作用表現(xiàn)為:固氮菌增加4.58%～14.27%,放線(xiàn)菌增殖顯著,同時(shí)能抑制霉菌生長(zhǎng)[16].