常宇陽(yáng)，武小雯，郭海燕, 關(guān)桂君

(1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306;2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306;3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

芳香化酶(Aromatase)是內(nèi)源性雌激素合成的關(guān)鍵酶[1]。哺乳類和鳥類中，芳香化酶由一個(gè)單拷貝的cyp19基因所編碼[2]，在魚類中則存在兩種不同的芳香化酶編碼基因cyp19a和cyp19b。青鳉(Japanese medaka HdrR，Oryziaslatipes)胚胎發(fā)育時(shí)期，雌雄魚腦部cyp19b的表達(dá)沒(méi)有明顯差別，隨著青春期性成熟過(guò)程開始，cyp19b表達(dá)開始出現(xiàn)雌雄性差，腦中cyp19b表達(dá)量雌性高于雄性，提示cyp19b可能參與腦-性腺軸的雌雄性分化調(diào)控[3]。除了在腦中表達(dá)，cyp19b在魚類的性腺、肝臟等器官中也有表達(dá)[4]。cyp19a主要在卵巢中表達(dá)，是雌激素合成關(guān)鍵酶，以維持卵巢和卵母細(xì)胞發(fā)育?；瘜W(xué)誘導(dǎo)突變(ENU-based mutagenesis)青鳉cyp19a研究顯示，cyp19a缺失突變個(gè)體有早期卵巢發(fā)育，但在青春期之后因部分卵巢退化而出現(xiàn)卵巢向精巢轉(zhuǎn)化的XX雄性逆轉(zhuǎn)表型。并且cyp19a和cyp19b雙突變個(gè)體表型同cyp19a單獨(dú)敲除的表型基本一致，證明內(nèi)源性雌激素不是XX生殖細(xì)胞進(jìn)入卵細(xì)胞早期發(fā)育的必需因子[5]。由于青鳉cyp19b的功能未知，我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)了靶向敲除cyp19b，成功建立了可遺傳的cyp19b缺失品系。

青鳉與人類一樣擁有XY型性別決定系統(tǒng)[6]，這使得青鳉成為研究性別調(diào)控和性別分化的良好模式動(dòng)物。其繁殖快，世代周期短，每天都能產(chǎn)卵，并且胚胎透明，能方便地進(jìn)行顯微注射操作。近年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于操作簡(jiǎn)便、效率高，在青鳉基因編輯中已經(jīng)有不少成功的應(yīng)用[7-8]。研究使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過(guò)直接注射gRNA和Cas9蛋白進(jìn)行基因編輯，免去了質(zhì)粒構(gòu)建等步驟，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程[9-11]。青鳉cyp19b基因敲除品系的建立，將為研究芳香化酶在性腺性別分化中的作用提供了實(shí)驗(yàn)素材。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及養(yǎng)殖條件

采用的青鳉為HdrR品系，飼養(yǎng)在26 ℃～28 ℃的循環(huán)水箱系統(tǒng)中，光暗循環(huán)時(shí)間為14/10 h。實(shí)驗(yàn)涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，都遵照上海海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的規(guī)定嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2 基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

1.2.1 序列比對(duì)分析保守結(jié)構(gòu)域

設(shè)計(jì)靶點(diǎn)前，首先要對(duì)目的基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析。使用ensemble(http://www.ensembl.org)網(wǎng)站檢索和下載人(Homosapiens，Hum)、雞(Gallusgallus,Chk)、青鳉(Oryziaslatipes，Ola)、羅非魚(Oreochromisniloticus，Ore)的Cyp19b蛋白序列，采用 Vector NTI11.5進(jìn)行氨基酸同源性序列比對(duì)分析，并根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org)，將蛋白質(zhì)氨基酸序列同源保守的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行標(biāo)注。

1.2.2 在保守結(jié)構(gòu)域上設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)

通過(guò)crisprscan(https://www.crisprscan.org/)網(wǎng)站[12]，分別在青鳉cyp19b基因的第2和第4外顯子上檢索預(yù)測(cè)CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的靶向敲除位點(diǎn)，選擇評(píng)分高且不易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的2個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在選定的靶序列5′端加上T7啟動(dòng)子序列，3′端加上能通過(guò)PCR與gRNA scaffold相連的序列(表1中下劃線顯示)，最終合成的序列為cyp19bgRNA1和cyp19bgRNA2(表1)。還要合成一段gRNA-scaffold序列,合成的序列如表1所示。上述寡聚核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成并提供。

表1 用于gRNA合成的DNA片段

1.3 gRNA的制備

將cyp19bgRNA1和cyp19bgRNA2分別通過(guò)PCR與SgRNA-scaffold 相連。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性 30 s，65 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min。PCR的產(chǎn)物通過(guò)QIAquick PCR Purification Kit試劑盒(QIAGEN,28104)進(jìn)行純化，之后通過(guò)MAXIscript T7 In Vitro Transcription Kit(Thermo Fisher，AM1312)試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到gRNA1和gRNA2。通過(guò)氯化鋰(LiCl)沉淀法純化RNA(向體外轉(zhuǎn)錄得到的gRNA中加入1/10體積的4 mol/L LiCl和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，放置在-80 ℃冰箱1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸棄上清液，再用70%乙醇清洗沉淀。移除乙醇，等離心管內(nèi)殘留的乙醇揮發(fā)后，用20 μL無(wú)酶水溶解沉淀，即得到純化后的gRNA)。純化完成放入-80 ℃冰箱備用。

1.4 顯微注射

顯微注射液的組成：gRNA1和gRNA2濃度均為100 ng/mL，Cas9蛋白(金斯瑞GeneScript,Z03385-100)150 ng/mL。注射前一天，用隔離缸將青鳉的雄性與雌性隔離，注射當(dāng)天解除隔離，使之交配并收取受精卵。青鳉自然交配受精后，卵細(xì)胞被激活進(jìn)入減數(shù)分裂II期分裂相，并釋放極體。單倍體精子和卵子的細(xì)胞核融合最終形成合子，細(xì)胞質(zhì)由植物極向動(dòng)物極進(jìn)行遷移。大約在30 min后抵達(dá)動(dòng)物極，顯微鏡下觀察到半透明凹陷狀單一細(xì)胞。用毛細(xì)管顯微注射針，將配制的gRNA和Cas9蛋白混合液，注入此單一細(xì)胞內(nèi)。

1.5 突變鑒定及純合子選育

將注射后的胚胎養(yǎng)至性成熟，剪尾鰭用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP324-03)提取基因組DNA，再用引物Fw9和Rv10(表1)進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用T7E1(金斯瑞GeneScript, Z03396-250)酶切，能切開的即為突變體F0代。將F0代突變體，與相對(duì)應(yīng)的雌或雄性野生型青鳉進(jìn)行配對(duì)交配(外交)。將子代養(yǎng)至成魚，再提取DNA，用Fw5和Rv6引物PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆并送測(cè)質(zhì)粒，得到F1代雜合子突變型。將確認(rèn)的F1代具有相同突變型的雜合子雌雄個(gè)體進(jìn)行配對(duì)雜交，最終得到F2代cyp19b基因敲除的純合子青鳉。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyp19基因不同物種間的進(jìn)化保守性

青鳉cyp19b基因編碼499個(gè)氨基酸，并且含有一個(gè)細(xì)胞色素P450同工酶特有同源結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列從魚類到人Cyp19蛋白中都保守存在，是蛋白酶催化活性必不可缺的(圖 1)。由于這一結(jié)構(gòu)域在Cyp19a和Cyp19b中都存在，在設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)時(shí)，既要保證破壞Cyp19b中P450功能結(jié)構(gòu)域，又要避開因?yàn)镻450結(jié)構(gòu)域相似度高而破壞Cyp19a功能的靶點(diǎn)。

圖1 不同物種的Cyp19氨基酸序列同源比對(duì)

2.2 cyp19b基因敲除青鳉的篩選和鑒定

設(shè)計(jì)的基因敲除雙靶位點(diǎn)如圖2(a)所示。取5條顯微注射后的成魚尾鰭DNA，用Fw9和Rv10引物進(jìn)行基因組PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行T7E1酶切消化，其結(jié)果顯示為野生型(WT)未能被T7E1酶切消化，因而呈一條帶，如圖2(b)WT所示。#1、#2、#3、#5同WT一樣，不能被T7E1酶切消化；而#4個(gè)體，因其DNA雙鏈錯(cuò)配而被T7E1酶切消化，酶切反應(yīng)呈陽(yáng)性，出現(xiàn)WT以外的兩條帶。這條F0突變體是雄魚，我們將其與3條野生型的雌魚進(jìn)行配對(duì)，并將其產(chǎn)生的子代養(yǎng)大。

(a)青鳉cyp19b基因敲除策略示意圖；(b)F0代青鳉突變體的篩選鑒定電泳圖(T7E1酶切)

2.3 cyp19b基因敲除F1代青鳉的鑒定

針對(duì)F0代突變型種魚與正常青鳉雜交得到的子代青鳉，取尾鰭DNA進(jìn)行靶點(diǎn)區(qū)域的基因組鑒定，分離得到兩種可遺傳的突變類型[圖3(b)]。第1種是因雙靶點(diǎn)的有效切割，導(dǎo)致562 bp的缺失，并同時(shí)插入9 bp堿基的突變體，我們將其命名為Mut1。Mut1型突變的雜合子用引物Fw5和Rv6進(jìn)行PCR能夠擴(kuò)增得到兩條帶，沒(méi)有突變的條帶是920 bp，發(fā)生突變的條帶是367 bp[圖 3(b)]。第2種是在第1個(gè)靶位點(diǎn)缺失了5 bp，在第2個(gè)靶位點(diǎn)插入了10 bp，命名為Mut2。在Mut2的特異序列位點(diǎn)附近，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物Fw13和Rv14(表1)，這對(duì)引物能夠有效和特異性擴(kuò)增Mut2突變類型的雜合子或者純合子，得到長(zhǎng)度為579 bp的PCR產(chǎn)物，而野生型則無(wú)PCR擴(kuò)增條帶[圖 3(a)]。雖然特異性引物Fw13和Rv14能鑒別野生型和Mut2突變型，但無(wú)法區(qū)分雜合子和純合子突變，還要利用Fw5和Rv6引物對(duì)其進(jìn)行基因組PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序來(lái)最終確認(rèn)Mut2的雜合子或純合子。DNA測(cè)序的峰圖顯示，靶位點(diǎn)處有重疊峰的為雜合子，靶位點(diǎn)處呈現(xiàn)單峰，并且序列不同于野生型的為純合子[圖3(c)]。

突變體氨基酸序列顯示，Mut2因缺失5個(gè)堿基產(chǎn)生移碼突變和終止密碼子的提前出現(xiàn)，形成缺失P450功能結(jié)構(gòu)域的蛋白產(chǎn)物，導(dǎo)致Cyp19b功能喪失[圖 3(d)]。Mut1突變體雖發(fā)生大片段缺失，但沒(méi)有發(fā)生移碼突變，最終導(dǎo)致在保守的P450結(jié)構(gòu)域上丟失130個(gè)氨基酸，推測(cè)Mut1型突變體的蛋白酶活性功能也會(huì)部分或完全受損。

(a)野生型和兩種突變型的DNA序列；(b)兩種突變型的電泳鑒定；(c)兩種突變型的DNA測(cè)序峰圖；(d)野生型和兩種突變型(完全或部分缺失P450結(jié)構(gòu)域)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列

2.4 青鳉Cyp19b敲除型純合子的篩選及其表型觀察分析

將具有相同突變基因型的cyp19b+/-的性成熟青鳉雌雄配對(duì)，產(chǎn)生的子代3個(gè)月性成熟后剪取尾鰭，將抽提得到的基因組DNA為模板，用特異引物進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，篩選得到純合子。初步觀察顯示，cyp19b-/-純合子沒(méi)有發(fā)生明顯的胚胎期死亡，基本上都能夠正常發(fā)育至成魚。性成熟的cyp19b-/-純合子青鳉有雄性也有雌性，目前鑒定得到Mut1純合子7條雄魚和5條雌魚，Mut2純合子5條雄魚和4條雌魚。兩種突變類型的純合子均可正常交配繁殖子代，說(shuō)明cyp19b基因不是胚胎發(fā)生發(fā)育必不可少的因子。

3 討論

研究在青鳉中首先實(shí)施了用PCR直接擴(kuò)增gRNA模板的簡(jiǎn)易CRISPR/Cas9方法敲除cyp19b基因，并成功篩選出兩種突變純合子(cyp19b-/-Mut1 & Mut2)。相比單靶點(diǎn)敲除，雙靶點(diǎn)可在不同位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行敲除而產(chǎn)生靶基因的大片段缺失，既提升敲除概率，又能確保靶向基因功能區(qū)域的徹底敲除，還有利于突變型的PCR篩選。但是多靶點(diǎn)同時(shí)敲除，也意味著脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的增加[13]。為了避免基因編輯過(guò)程中產(chǎn)生脫靶，應(yīng)該選擇潛在脫靶效應(yīng)少的靶位點(diǎn)，用gRNA和Cas9蛋白質(zhì)的最佳匹配濃度實(shí)施顯微注射，最大限度地降低脫靶效應(yīng)發(fā)生[14]。實(shí)驗(yàn)得到的兩個(gè)不同類型的突變，全部或部分破壞了cyp19b基因的細(xì)胞色素氧化酶P450結(jié)構(gòu)域[15-16]，從而破壞了Cyp19b蛋白產(chǎn)物的生物學(xué)活性。初步觀察發(fā)現(xiàn)cyp19b突變型純合子雌雄個(gè)體均能夠正常生長(zhǎng)繁殖。斑馬魚中敲除cyp19b基因顯示其精巢和卵巢發(fā)育正常，也能夠正常繁殖[17]。然而，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)cyp19b基因敲除的羅非魚雄性精巢，其輸精管發(fā)育異常而形成輸精管阻塞纖維化，導(dǎo)致雄性不育[18]，提示羅非魚和小型魚類(青鳉和斑馬魚)的cyp19b基因在精巢發(fā)育中的功能多樣性。魚類的性別決定既有遺傳決定的XY型或ZW型，也有溫度、光照或pH等非遺傳決定因素。魚類和其他脊椎動(dòng)物的性別決定因素雖呈多樣性，但調(diào)控生殖細(xì)胞進(jìn)入雌雄分化的信號(hào)通路仍有高度的進(jìn)化保守性。最新研究發(fā)現(xiàn)Elavl2和Ddx6是調(diào)控小鼠卵泡休眠期進(jìn)入活躍期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子[19-20]，在gsdf缺失卵巢中也顯著升高，提示Elavl2和Ddx6可能受gsdf調(diào)控，參與調(diào)控卵泡休眠期進(jìn)入活躍期的轉(zhuǎn)變過(guò)程。我們還發(fā)現(xiàn)gsdf和cyp19b雙敲的XY性腺中，卵母細(xì)胞數(shù)目顯著下降，提示cyp19b可能同Elavl2和Ddx6，或其他未知因子協(xié)同參與生殖干細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控。

青鳉cyp19a和cyp19b在性分化過(guò)程中的表達(dá)部位不同，在發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)不重疊，推測(cè)兩者功能互補(bǔ)的可能性不高[21]。cyp19a和cyp19b雙敲結(jié)果[5]和本實(shí)驗(yàn)cyp19b單獨(dú)敲除之后的結(jié)果，都說(shuō)明青鳉cyp19b對(duì)性腺分化和發(fā)育的影響是有限的，其他因子可能替代cyp19b參與調(diào)控生殖細(xì)胞性分化的作用。Cyp19b敲除品系為進(jìn)一步研究其功能以及其他因子的遺傳補(bǔ)償作用，提供了活體研究平臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)首次采用改良的簡(jiǎn)易CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)青鳉cyp19b基因進(jìn)行敲除，成功得到了兩個(gè)不同突變類型的cyp19b敲除青鳉。cyp19b敲除青鳉模型的成功構(gòu)建為研究腦型芳香化酶在青鳉腦和性腺性別分化中的作用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。