王 娟，申豐銘，張崢嶸，朱國旗

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230038)

抑郁癥已經(jīng)成為全球疾病負(fù)擔(dān)的重要原因之一[1]，目前尚無有效治療手段。海馬是一個(gè)重要的腦區(qū)，在情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是抑郁研究較為廣泛的腦區(qū)[2]。在抑郁癥的病因?qū)W研究中，突觸的作用已引起越來越多的關(guān)注。在抑郁動(dòng)物模型中，突觸可塑性的調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常[3-4]，以突觸后致密蛋白-95(Postsynaptic density protein 95, PSD-95)、活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Activity-regulated cytoskeleton-associated protein, Arc)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等的表達(dá)下降為典型[5-6]。炎癥是抑郁發(fā)病的另一個(gè)重要機(jī)理，已發(fā)現(xiàn)抑郁患者血清中炎癥生物標(biāo)志物水平增加[7-8]，而星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化是炎癥發(fā)生重要的源頭[5]。人參皂苷Rg1是中藥人參的主要活性成分，具有調(diào)控可塑性、抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶等生物學(xué)活性[9]。研究表明人參皂苷Rg1具有改善小鼠抑郁樣行為[10]。但是人參皂苷Rg1對抑郁干預(yù)的機(jī)理，特別是對海馬突觸可塑性和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)仍然未知。本研究通過慢性溫和不可預(yù)見應(yīng)激模型(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)研究人參皂苷Rg1對抑郁樣行為的干預(yù)作用，并利用免疫印跡以及免疫熒光等方法，從炎癥反應(yīng)和突觸可塑性兩個(gè)方面探討人參皂苷Rg1干預(yù)CUMS小鼠抑郁樣行為的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥物

30只雄性C57BL/6小鼠(2月齡，體重：20～25 g)，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(皖)2016-0009)。將小鼠飼養(yǎng)在溫度為22 ℃±2 ℃，相對濕度為45%～65%的環(huán)境中，經(jīng)歷12 h的明/暗循環(huán)，可隨意飲水和攝食。實(shí)驗(yàn)方案由安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)監(jiān)督。人參皂苷Rg1(HPLC ≥ 98%，源葉生物科技，上海，中國)。

1.2 動(dòng)物分組、造模與給藥

30只雄性C57小鼠喂養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，然后將小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只小鼠(n=6)，分別是正常組、CUMS模型組、CUMS+人參皂苷Rg1高、中、低劑量給藥組(給藥劑量分別是40、20 和10 mg/kg)。

在CUMS造模期間，一共使用8種刺激：夾尾5 min，飲食剝奪24 h，飲水剝奪24 h，晝夜顛倒24 h，束縛2 h，電擊(3次，強(qiáng)度為1 mA，持續(xù)2 s)，潮濕環(huán)境2 h，熱刺激(45 ℃～50 ℃，5 min)，每天隨機(jī)抽取兩種刺激，使小鼠無法預(yù)測刺激，共計(jì)28 d；人參皂苷Rg1組在第21天后開始進(jìn)行腹腔注射給藥(40、20 和10 mg/kg，每天1次)，正常組和CUMS模型組腹腔注射等量的生理鹽水。給藥一周后進(jìn)行行為學(xué)測試，收集海馬組織(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

1.3 實(shí)驗(yàn)觀測指標(biāo)

1.3.1 糖水偏好

每次測試時(shí)，將2個(gè)瓶子的位置進(jìn)行顛倒。在小鼠適應(yīng)期間，訓(xùn)練其品嘗蔗糖水。待適應(yīng)完成后，禁水24 h后進(jìn)行蔗糖偏好測試。通過量筒記錄糖水的消耗，每周測試一次。蔗糖偏好指數(shù)=蔗糖消耗量/飲水總量×100%。

1.3.2 體重變化

從第1周開始，稱量小鼠體重，每隔1周測1次，共計(jì)5次，并記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.3 懸尾實(shí)驗(yàn)(Tail suspension test，TST)

將小鼠放在測試房間中1 h適應(yīng)環(huán)境。在安靜的環(huán)境中進(jìn)行TST，在小鼠尾端2 cm處固定，使小鼠保持倒掛狀態(tài)，頭部距臺(tái)面約50 cm,兩側(cè)用板隔開動(dòng)物視線。允許其運(yùn)動(dòng)6 min，并通過Supermaze軟件(上海欣軟信息科技)記錄其行為。前2 min是適應(yīng)期，記錄后4 min小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.4 曠場實(shí)驗(yàn)(Open field test，OFT)

將小鼠置于立方體室的中心[400 mm(W)×400 mm(H)×400 mm(D)]，并使其自由移動(dòng)5 min。使用自動(dòng)分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技)比較各組之間的站立次數(shù)，中心路程與總路程的比值。

1.3.5 強(qiáng)迫游泳(Forced swimming test，F(xiàn)ST)

將小鼠分別置于水溫為22 ℃±3 ℃的2 000 mL玻璃容器中，允許動(dòng)物運(yùn)動(dòng)6 min，并通過Supermaze軟件(上海欣軟信息科技)記錄其行為。前2 min是適應(yīng)期，記錄后4 min小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.6 蛋白免疫印跡(Western Blot, WB)

從各組獲得來自動(dòng)物的海馬組織，勻漿并裂解，使用BCA試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology)檢測蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%體積分?jǐn)?shù)凝膠)在110 V下分離60 min，并在200 mA下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上2 h。在室溫下，將膜用5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂牛奶(溶于含0.1%體積分?jǐn)?shù)Tween-20的PBS中)封閉2 h，然后在4 ℃下與相應(yīng)抗體孵育過夜：PSD95(1∶ 1 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)；Arc(1∶ 1 000; Synaptic Systems, Goettingen, Germany)；GFAP(1∶ 1 000; Beyotime, Beijing, China)；Iba1(1∶ 1 000; Beyotime, Beijing, China)；BDNF(1∶ 1 000; Novus, Colorado, USA)；NF-κB(1∶ 1 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)；β-actin(1∶ 1 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)，隨后在室溫下與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG(1∶ 10 000; Zs-Bio, Beijing, China)孵育2 h。使用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行分析，計(jì)算條帶的光密度值。

1.3.7 免疫熒光(Immunofluorescent staining)

全腦于4 ℃在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛中固定24 h后，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的蔗糖水中脫水24 h，并在冷凍切片機(jī)上切片，厚度為20 μm。將切片在含有體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清和體積分?jǐn)?shù)0.4%Triton X-100的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中封閉1 h。然后在4 ℃下與相應(yīng)的一抗孵育過夜：GFAP(1∶ 100, Beyotime, Beijing, China)。將切片在PBS中洗滌3次(每次15 min)。并與熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor?488)(1∶ 200, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)室溫下孵育2 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片。用FV1000 Olympus激光共焦掃描顯微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)拍攝圖像(放大倍數(shù)：×200)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析使用方差分析(ANOVA)進(jìn)行，并使用Bonferroni分析組間差異，以P值小于0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷Rg1減輕CUMS誘導(dǎo)的抑郁樣行為

第一周各組小鼠體重沒有顯著差異[圖2(a)，P>0.05)]。而在CUMS造模后的一周，除正常組外的小鼠體重均有下降趨勢[圖2(a)]，而給予人參皂苷Rg1后，小鼠的體重較模型組有明顯的上升趨勢，其中以20 mg/kg組和40 mg/kg組小鼠體重上升較顯著[圖2(a)，P<0.05]。與正常組相比，CUMS應(yīng)激后的小鼠對糖水的喜好程度明顯偏低(P<0.05)；而與CUMS模型組比較，人參皂苷Rg1給藥組對糖水的喜好程度有上升趨勢，其中以20 mg/kg組和40 mg/kg組小鼠上升較為顯著[圖2(b)，P<0.05]。

模型組小鼠較正常組小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)[圖2(c)]和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[圖2(d)]中的不動(dòng)時(shí)間均顯著增加(vs 正常組，P<0.05)。人參皂苷Rg1組小鼠不動(dòng)時(shí)間均顯著減少(vs 模型組P<0.05)。曠場實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠之間的站立次數(shù)[圖2(e)，P>0.05]及在中心路程與總路程之比無顯著性差異[圖2(f)，P>0.05]。

(a)小鼠體重變化；(b)糖水偏好指數(shù)；(c)懸尾實(shí)驗(yàn)后4 min的不動(dòng)時(shí)間；(d)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)后4 min的不動(dòng)時(shí)間；(e)曠場實(shí)驗(yàn)中小鼠站立次數(shù)；(f)曠場實(shí)驗(yàn)中小鼠中心路程/總路程。每組6只(n=6), #：P<0.05 vs 正常組; *：P<0.05 vs 模型組

in CUMS mice

2.2 人參皂苷Rg1抑制CUMS誘導(dǎo)的海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)下降

與正常組相比，CUMS小鼠海馬PSD95、Arc和BDNF表達(dá)均下降(P<0.05)。人參皂苷Rg1能抑制CUMS小鼠PSD95[圖3(a)]、Arc[圖3(b)]和BDNF表達(dá)的下降[圖3(c)],其中以20 mg/kg組和40 mg/kg組作用較為顯著(vs 模型組，P<0.05)。

(a)PSD95表達(dá)水平；(b)Arc表達(dá)水平；(c)BDNF表達(dá)水平。每組n=5～6;#:P<0.05 vs 正常組; *:P<0.05 vs 模型組

2.3 人參皂苷Rg1下調(diào)CUMS誘導(dǎo)的海馬膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物和NF-κB的表達(dá)

CUMS模型小鼠的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP表達(dá)上升(vs 正常組,P<0.05)，而人參皂苷Rg1能抑制CUMS誘導(dǎo)的GFAP表達(dá)的上升[圖4(a)，vs CUMS,P<0.05]。與正常組比較，CUMS模型組小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1的表達(dá)也升高，而人參皂苷Rg1能抑制CUMS誘導(dǎo)的Iba1表達(dá)上升[圖4(b)，vs CUMS,P<0.05)]。NF-κB相關(guān)通路與炎癥密切相關(guān)，和正常組比較，CUMS模型組NF-κB表達(dá)顯著增高，而人參皂苷Rg1顯著抑制CUMS誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)[圖4(c)，vs CUMS,P<0.05)]。免疫熒光結(jié)果也顯示，CUMS組小鼠海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加，而給予人參皂苷Rg1(40 mg/kg)可以抑制CUMS誘導(dǎo)的海馬DG區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化[圖4(d)，P<0.05]。

(a)GFAP表達(dá)水平；(b)Iba1表達(dá)水平；(c)NF-κB表達(dá)水平；(d)GFAP免疫熒光代表性圖。每組n=5～6;#:P<0.05 vs 正常組; *:P<0.05 vs 模型組

3 討論與總結(jié)

抑郁癥是常見精神疾病之一，目前臨床上常用的抗抑郁藥仍以西藥為主，如：三環(huán)類抗抑郁藥，單胺氧化酶抑制劑等。盡管隨機(jī)臨床試驗(yàn)已經(jīng)確定了抗抑郁藥的療效[11]，但當(dāng)前可用的抗抑郁藥需要數(shù)周至數(shù)月才能產(chǎn)生治療效果，有超過30%的患者對這些藥物沒有反應(yīng)[12]，并且大多數(shù)藥物具有不良反應(yīng)。中藥以高安全性和耐受性為抑郁癥治療提供有希望的替代方法。人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[13]。已有證據(jù)表明人參皂苷Rg1在抑郁的發(fā)生中起一定的保護(hù)作用[14]，但有關(guān)人參皂苷Rg1對于抑郁調(diào)節(jié)機(jī)制，特別是對海馬區(qū)神經(jīng)突觸可塑性和炎癥反應(yīng)的調(diào)控仍然未知。

研究采用CUMS誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型，評價(jià)人參皂苷Rg1的抗抑郁作用?？旄腥笔且钟舻囊粋€(gè)重要表現(xiàn)，而糖水偏好實(shí)驗(yàn)是評價(jià)動(dòng)物快感缺失程度的良好指標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)CUMS刺激后的小鼠對糖水的攝取量明顯降低，而人參皂苷Rg1可顯著增加抑郁小鼠的糖水?dāng)z取量。強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)是用來評價(jià)抗抑郁藥療效的另一重要指標(biāo)，靜止不動(dòng)時(shí)間代表動(dòng)物抑郁的程度[16]。CUMS小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均顯著上升，人參皂苷Rg1給藥明顯縮短小鼠的不動(dòng)時(shí)間。這些結(jié)果表明人參皂苷Rg1能保護(hù)CUMS誘導(dǎo)的抑郁樣行為。研究還通過曠場實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠自主活動(dòng)的變化，各組小鼠的自主活動(dòng)無顯著性差異，表明人參皂苷Rg1治療后對小鼠的行為學(xué)改變確實(shí)是由于其抗抑郁作用而不是受小鼠自主活動(dòng)的影響。

突觸可塑性是大腦動(dòng)態(tài)適應(yīng)外部刺激并調(diào)節(jié)突觸強(qiáng)度最終形成網(wǎng)絡(luò)功能的基本能力[17]。有研究表明突觸可塑性的異常在抑郁的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[18]。Arc是神經(jīng)元表達(dá)活性調(diào)節(jié)的早期基因產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)樹突棘密度和重塑中起重要作用[19]。PSD95是突觸后膜上重要且豐富的腳手架蛋白，對于突觸可塑性調(diào)節(jié)起著重要的作用[20]。BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常重要的生長因子，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元生長、功能性神經(jīng)元連接、突觸形成和突觸可塑性至關(guān)重要[21]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致這些重要的突觸可塑性相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白水平的下降，而給予人參皂苷Rg1顯著改善這些突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)。系列結(jié)果均提示人參皂苷Rg1可能通過抑制CUMS誘導(dǎo)的突觸相關(guān)蛋白的下降來發(fā)揮保護(hù)抑郁樣行為的作用。

炎癥在抑郁的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用[22]。而小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中主要的先天免疫細(xì)胞，它們會(huì)被感染、壓力等引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥所激活[23-24]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞會(huì)引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，釋放促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、炎性介質(zhì)等，并誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互激活[25]。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化升高與抑郁的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[24,25-27]。而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以改善動(dòng)物抑郁樣行為[29-30]。研究結(jié)果指出在CUMS誘發(fā)的抑郁模型中，海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的升高有關(guān)。而人參皂苷Rg1可以抑制海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。此外，研究結(jié)果還表明CUMS小鼠海馬NF-κB的表達(dá)升高，而人參皂苷Rg1可抑制海馬NF-κB的表達(dá)。NF-κB作為一種快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，是機(jī)體免疫、炎癥等過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[31]。抑制NF-κB及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以改善神經(jīng)炎癥[5]，而炎癥與抑郁密切相關(guān)。因此，人參皂苷Rg1的抗抑郁作用可能與抑制小鼠海馬NF-κB表達(dá)從而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)沒有對炎癥因子進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可以減輕CUMS誘發(fā)的小鼠抑郁樣行為，其抗抑郁作用可能是通過促進(jìn)海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)以及抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。