董 毅，董一港

(1.華東師范大學(xué) 青少年健康評價與運動干預(yù)教育部重點實驗室，上海 200241；2.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241)

2017年，中國科學(xué)院北京動物研究所周琪院士領(lǐng)銜的科研人員與鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科醫(yī)生將400 萬個人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)衍生的未成熟神經(jīng)元(神經(jīng)前體細(xì)胞)注入帕金森病(PD)患者的大腦，標(biāo)志著國內(nèi)外使用hESC治療帕金森病臨床試驗的開始，這也是干細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域的又一次突破性進(jìn)展[1]。人體內(nèi)具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞群體，稱為干細(xì)胞(stem cell)，它能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自己完全相同的子細(xì)胞，并分化成為機(jī)體內(nèi)各類祖細(xì)胞[2]。干細(xì)胞有多種分類方式，根據(jù)來源不同，可以將其分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)和成體干細(xì)胞(adult stem cell)[3]。

胚胎干細(xì)胞是指哺乳動物胚胎發(fā)育早期的多能性干細(xì)胞[4-5]，它區(qū)別于其他組織特異性干細(xì)胞的特征包括在長時間培養(yǎng)過程中可以無限增殖的同時還能保持其正常核型和多能性，后者表現(xiàn)為體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞在一定條件下，可以分化為3個胚層的任一細(xì)胞：內(nèi)胚層、中胚層和外胚層[6-7]。目前為止，科學(xué)家利用不同的方法分離、培養(yǎng)hESCs并取得了一定的成果，在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用等領(lǐng)域都具有很大的貢獻(xiàn)，然而在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞功能方面，仍有大量的問題有待研究。因此在本篇綜述中，我們首先簡要總結(jié)了成功分離、培養(yǎng)和分化為特定細(xì)胞系的各種策略，著重從單細(xì)胞、突觸傳遞以及神經(jīng)回路等層面概述hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元在體內(nèi)及體外研究中的作用。

1 人類胚胎干細(xì)胞概述

被公認(rèn)為人類胚胎干細(xì)胞之父以及該領(lǐng)域未來研究預(yù)測者的James Thomson，在描述hESC時說：人類胚胎干細(xì)胞的發(fā)育可塑性使其在基礎(chǔ)研究和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有無限的可能。研究發(fā)現(xiàn)來源于胚胎的細(xì)胞雖然很原始，但卻可以表現(xiàn)出自我調(diào)節(jié)行為：一個著床前的胚胎，如果被切成兩半，仍可以單獨形成兩個不同的胚胎；如果兩個處于不同發(fā)育階段的胚胎融合在一起，所產(chǎn)生的單集合胚胎則又會再次正常發(fā)育，并包含來自4個不同親本的遺傳信息。這說明這種發(fā)育可塑性使胚胎細(xì)胞不僅能夠在不同的發(fā)育階段混合，而且還保持著正常發(fā)育的能力。

實際上從Thomson等[8]1998年第一次成功分離出人類胚胎干細(xì)胞之后，人們發(fā)現(xiàn)一旦將hESC從胚泡中取出并在特定因子條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，它們就會開始繁殖并分化成各種細(xì)胞群。hESC也因其能夠無限增殖以及可以分化為全身各類細(xì)胞的特性吸引了大量研究者的興趣。從那時起，有關(guān)人類胚胎干細(xì)胞如何分離、培養(yǎng)以及分化成各類型細(xì)胞的問題成為大家爭相攻克的課題。

1.1 人類胚胎干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和獲得

在卵子受精和二倍體合子形成之后，受精卵經(jīng)過一系列的卵裂產(chǎn)生了一組稱為卵裂球的細(xì)胞，這些細(xì)胞進(jìn)一步分裂并重新排列形成囊胚，囊胚由稱為胚結(jié)的內(nèi)層細(xì)胞和稱為滋養(yǎng)層的外層細(xì)胞組成[9]。胚結(jié)還被稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)，其中的細(xì)胞最終可以發(fā)育成機(jī)體所有組織和器官，因此ICM是胚胎干細(xì)胞的最好來源。然而Sherman等在小鼠胚泡早期發(fā)育的研究中檢測了滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長、分化以及長期培養(yǎng)過程中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的增殖狀況，但最終并未在體外分化為所有3個胚層[10]。隨后幾年內(nèi)，科學(xué)家利用已建立的胚胎癌干細(xì)胞培養(yǎng)物開發(fā)出合適的培養(yǎng)條件并確定了多能胚胎干細(xì)胞分離的最佳階段，從而于1981年成功分離出世界上第一個穩(wěn)定的小鼠胚胎干細(xì)胞系[4-5,11]?；谛∈笈咛ジ杉?xì)胞系的開創(chuàng)性工作，以及Thomson在后來培養(yǎng)非人靈長類胚胎干細(xì)胞系的貢獻(xiàn)[12-13]，最終促成Thomson和Reubinoff成功分離并培養(yǎng)出了人類胚胎干細(xì)胞系[8,14]。

hESC的第一個困難和挑戰(zhàn)即是如何從人類胚胎中分離出干細(xì)胞，hESC通常從著床前或著床周期人類囊胚的ICM中獲得。研究人員最初通過機(jī)械解剖[15]或免疫外科手術(shù)[8,14,16]的方法去除透明帶和營養(yǎng)外胚層進(jìn)而分離出胚胎干細(xì)胞。但是免疫外科手術(shù)需要使用動物源性產(chǎn)品，如含有豚鼠血清的培養(yǎng)基；而暴露于動物源性產(chǎn)品則可能會導(dǎo)致一些病原體轉(zhuǎn)移到hESC，從而無法獲得臨床級的hESC系[17]。因此，使用機(jī)械壓力或酶分離ICM與營養(yǎng)外胚層，可以避免ICM與動物產(chǎn)品在衍生過程中的接觸，有利于之后的研究和應(yīng)用[15,18]。隨著研究的深入，科學(xué)家還開發(fā)出其他分離hESC的方法，如Turetsky等[19]通過使用激光束在透明帶上形成一個開口從而分離胚胎干細(xì)胞，這說明激光輔助顯微操作的方法也是ICM無異種分離中最有前途的技術(shù)之一[19-20]。

然而ICM的分離會導(dǎo)致胚胎被破壞，這引起了嚴(yán)重的倫理和政治問題[21]。為了解決這個問題，許多研究者致力于從胚胎發(fā)育的早期階段分離出細(xì)胞。Chung和 Klimanskaya等[22-23]在胚胎著床前的基因檢測期間，從患者體內(nèi)獲得攜帶單卵裂球的胚胎活檢，并且成功從單卵裂球活檢中獲得5個hESC系。來自單卵裂球的hESCs由于不會妨礙剩余卵裂球形成正常胚胎的能力避開了倫理爭議。同樣，由于既沒有產(chǎn)生胚胎也沒有破壞胚胎，通過人工授精產(chǎn)生的孤雌生殖胚胎，也已經(jīng)成為hESC理想的來源[24-26]。近年來，還有研究者嘗試?yán)皿w細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT)獲得hESC，如Chung等[27]將2名健康的35歲和75歲男性的皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞內(nèi)，使體細(xì)胞重編程為干細(xì)胞。到目前為止，世界范圍內(nèi)的科學(xué)家們已經(jīng)使用各種方法從不同的胚胎來源中獲得并建立了數(shù)百個hESC株系，這些hESC現(xiàn)已應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究。

1.2 人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)

hESC通?？梢圆捎脛游镌葱匝寤蜓逄娲镌谛∈笈咛コ衫w維細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)[8,14]。有研究證明添加無血清培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)亦可增強(qiáng)hESC的增殖并防止hESC發(fā)生分化[28]；近些年來研究人員還通過控制細(xì)胞代謝在本質(zhì)上調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分子特征，影響干細(xì)胞的增殖和分化[29]。盡管培養(yǎng)的方法有很多，但是一個合格hESC培養(yǎng)基的最基本條件即是在促進(jìn)hESC無限分裂增殖的同時維持hESC的未分化狀態(tài)。接下來將簡要概述用于改善hESC產(chǎn)生數(shù)量和質(zhì)量的各種培養(yǎng)條件。

1.2.1 動物源飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系

飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系是ESC體外培養(yǎng)建系中最常用的一種技術(shù)方法。目前最常用的飼養(yǎng)層是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，它被認(rèn)為是hESC培養(yǎng)過程中重要的成分。MEF可以促進(jìn)hESC的生長和擴(kuò)增，并且MEF分泌的生長因子和細(xì)胞因子對干細(xì)胞維持多能性也是必需的[8,14]。制備飼養(yǎng)層需要在MEF中加入胎牛血清，然而伴隨著hESC與MEF和動物血清的接觸，一系列健康問題也隨之而來：Cobo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，MEF細(xì)胞中存在能夠感染hESC的病毒顆粒；Llewelyn等[31]在使用牛血清培養(yǎng)hESC時，發(fā)現(xiàn)動物源性血清可能在培養(yǎng)過程中傳播朊病毒或其他動物病毒。還有報道稱，基于動物的細(xì)胞和血清可以在體外培養(yǎng)過程中通過細(xì)胞間的相互作用將病毒或其他病原體傳播到胚胎干細(xì)胞中[32-33]。因此，使用含有動物細(xì)胞或血清的培養(yǎng)基可能會將動物來源的感染性病原體傳播給hESC，從而可能給患者帶來巨大危險。

1.2.2 非動物源飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系

為了避免病毒傳播和跨物種污染，研究人員開發(fā)出不含動物成分同時可以支持hESC生長和擴(kuò)增的培養(yǎng)基。研究發(fā)現(xiàn)使用人類細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層也可以產(chǎn)生堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和激活素A，進(jìn)而促進(jìn)hESC的增殖并維持其多能性，因此可用于hESC的培養(yǎng)[34-35]。如Cho等[36]在實驗中曾使用臍帶基質(zhì)細(xì)胞制成的飼養(yǎng)層系統(tǒng)成功培養(yǎng)了hESC；Gao等[37]也通過實驗證明了子宮內(nèi)膜細(xì)胞在hESC生長和分化方面比小鼠胚胎成纖維細(xì)胞具有更好的作用。此外人類輸卵管細(xì)胞[38]、胎兒包皮[39]、骨髓[40]以及胎盤細(xì)胞等[37]也可在培養(yǎng)hESC的過程中發(fā)揮重要作用。上述事實都證明了可以使用非動物飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC，但其依然存在許多諸如使用包皮、胎兒或骨髓來源的飼養(yǎng)層引發(fā)的倫理限制以及由于飼養(yǎng)細(xì)胞群之間的差異太大，使得飼養(yǎng)層的維持非常困難，在實際操作過程中耗時費力等問題。

1.2.3 無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系

由于動物和人類飼養(yǎng)細(xì)胞都具有局限性，越來越多的實驗室在培養(yǎng)hESCs時選擇使用無飼養(yǎng)層的化學(xué)培養(yǎng)基。研究者將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或重組蛋白以及生長因子(包括激活素A、bFGF以及TGF-β1等)加入到化學(xué)培養(yǎng)基中，從而為干細(xì)胞創(chuàng)造體外培養(yǎng)條件[41-42]。在這些蛋白質(zhì)中，最常用的方法是將Matrigel(基底膜基質(zhì))與生長因子或條件培養(yǎng)基聯(lián)合使用以培養(yǎng)hESC[43]；除Matrigel外，F(xiàn)u等[44]還將纖維連接蛋白、層粘連蛋白和IV型膠原蛋白用于hESC的無異種培養(yǎng)中。毫無疑問，化學(xué)培養(yǎng)基與蛋白質(zhì)的使用顯著改善了hESC的培養(yǎng)條件。

1.2.4 3D培養(yǎng)體系

在培養(yǎng)hESC時，其細(xì)胞間的相互作用以及旁分泌或自分泌信號在維持hESC的未分化狀態(tài)中也起著重要作用，因此通過將hESC包封在特定尺寸的支架中以控制可擴(kuò)展培養(yǎng)物中細(xì)胞間相互作用的方法越來越受關(guān)注。Nur-E-Kamal等[45]曾使用合成聚酰胺基質(zhì)支架模擬基底膜的纖維網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)hESC，發(fā)現(xiàn)這樣的培養(yǎng)體系通過激活小GTP酶Rac以及磷酸肌醇3-激酶(PI3K)途徑增加了hESC的增殖能力；Gerecht等[46]使用透明質(zhì)酸(HA)水凝膠組成的基質(zhì)來培養(yǎng)hESC，通過外部刺激對水凝膠的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾從而操縱生物活性分子的時間和空間可用性。此外，Yim等[47]也通過實驗證明，hESC在3D培養(yǎng)中通過加強(qiáng)細(xì)胞間相互作用使增殖能力得以提高，說明與二維培養(yǎng)(2D)相比，三維(3D)培養(yǎng)更接近hESC在體內(nèi)的生存環(huán)境，從而更利于培養(yǎng)[48]。

1.3 人類胚胎干細(xì)胞的特性及測定

hESC具有兩大特性：(1)高度的分化潛能(pluripotency)。hESC可以在細(xì)胞培養(yǎng)的任何階段分化為3個胚胎生殖層中的任何一個[14,49]。(2)自我更新能力(self-renew)。hESC能夠在維持多能性的同時不斷增殖，因此可在體外培養(yǎng)條件下建立穩(wěn)定的細(xì)胞系。

1.3.1 hESC的形態(tài)特征和分子標(biāo)記

形態(tài)學(xué)上，hESC可在培養(yǎng)基中形成致密的球形細(xì)胞集落，集落內(nèi)的單個hESC則表現(xiàn)出高核質(zhì)比和大核仁的特點，說明在hESC增殖過程中，轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成非常活躍(圖1)。hESC的特征還在于能夠表達(dá)許多細(xì)胞表面標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子，包括階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)、SSEA-3、畸胎瘤衍生生長因子1(TDGF1)、生長分化因子3(GDF3)、TRA抗原、Oct3/4以及Nanog等[50-53]。這使研究人員能夠在體內(nèi)外監(jiān)測hESC的分化和發(fā)育行為。

在hESC的各種標(biāo)記中，OCT4(也稱OCT3或OCT3/4)在早期胚胎細(xì)胞的維持和交流方面的作用是獨一無二的：OCT4是早期胚胎細(xì)胞中特有表達(dá)的一種定向轉(zhuǎn)錄因子，由Pou5f1基因編碼，可以在維持內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞增殖的同時抑制細(xì)胞分化[52,54-55]。Wang等[56]發(fā)現(xiàn)與OCT4共同作用的還有SOX2和NANOG：OCT4可以和SOX2在sox-oct原件處形成一個復(fù)合體共同發(fā)揮作用；而NANOG則能夠通過與OCT4和SOX2各自的基因Pou5f1和Sox2相互作用來維持OCT4和SOX2的表達(dá)[56]。除OCT4外，Qi等[57]在將外源性BMP4導(dǎo)入BMP4缺失的胚胎干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外受體激酶(ERK)和p38有絲分裂激活蛋白激酶(MAPK)活性都顯著降低，說明BMP4可以通過抑制ERK和MAPK誘導(dǎo)與細(xì)胞分裂以及細(xì)胞分化有關(guān)的有絲分裂原和生長因子(如LIF、FGF和BMP)的下游信號傳導(dǎo)，進(jìn)而協(xié)助維持hESC的多能性和自我更新能力[57]。另外，轉(zhuǎn)化TGFβ通路的成員LEFTY1、LEFTY2以及GDF3也可以在多能干細(xì)胞中表達(dá)[58]。

1.3.2 hESC多能性的測定

hESC的多能性可以通過建立相應(yīng)的體內(nèi)和體外技術(shù)進(jìn)行檢測。到目前為止，在體內(nèi)檢測hESC最常用的方法是將未分化的hESC移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，檢測其是否會形成畸胎瘤[14,59-60]；畸胎瘤是由3個胚層組織構(gòu)成的一種良性腫瘤，對植入hESC從而形成畸胎瘤的分析是用來確定其分化潛能的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，還有學(xué)者提出了體外檢測胚狀體(EB)的方法：EB是不黏附的hESCs的球形聚集體[圖1(b)]，包含所有3個胚胎生殖層的細(xì)胞群；研究人員首先在體外培養(yǎng)hESCs，使其分化為胚狀體(EB)，隨后對其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，或通過RT-PCR檢測與3個胚層相關(guān)基因的表達(dá)情況從而確定hESC分化為各種細(xì)胞類型的能力。

(a)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hESC的緊密集落；(b)誘導(dǎo)分化后3 d的EB；(c)將EB鋪在涂有明膠的培養(yǎng)皿上48 h后出現(xiàn)分化組織

2 人類胚胎干細(xì)胞功能

2.1 hESC在疾病研究和應(yīng)用中的功能

人類胚胎干細(xì)胞可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下先分化成3個胚層繼而分化成體內(nèi)各種細(xì)胞，如胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞等；hESCs的這種多譜系潛力為治療眾多退行性疾病提供了新思路。

2.1.1 hESC誘導(dǎo)分化的內(nèi)胚層細(xì)胞

內(nèi)胚層衍生物主要包括在肺、肝、胰腺、膀胱、甲狀腺及消化系統(tǒng)中的各類細(xì)胞。產(chǎn)生內(nèi)胚層細(xì)胞的首要步驟是形成定形內(nèi)胚層，D’Amour等[62-63]在實驗中發(fā)現(xiàn)，在低血清條件下，可以通過添加高濃度的激活素A和Wnt3a，以階段特異性的方式將hESC選擇性誘導(dǎo)分化為定形內(nèi)胚層。定性內(nèi)胚層形成后，進(jìn)而分化為特定的祖細(xì)胞群，如胰島β細(xì)胞[64]、肺泡上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等，并在臨床上用于開發(fā)糖尿病、肺部疾病和急性肝衰竭/肝炎等疾病的細(xì)胞替代療法。

Kroon等[65]成功獲得了hESC誘導(dǎo)分化的胰島祖細(xì)胞，他們把hESC依次暴露于激活素A和Wnt3a中，然后添加角質(zhì)細(xì)胞生長因子或FGF7以誘導(dǎo)原腸管形成；隨后，向培養(yǎng)基中加入視黃酸和Noggin以抑制Shh和TGFβ信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞祖細(xì)胞的來源——前腸后端(posterior foregut)細(xì)胞；最后再將這些細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)以產(chǎn)生胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。Kroon等[65]將得到的細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它們能夠表現(xiàn)出胰島β細(xì)胞的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征，并具有產(chǎn)生胰島素的能力。在最近的研究中，Nair等[66]還發(fā)現(xiàn)通過分離和重新聚集未成熟的β細(xì)胞可以生成β細(xì)胞樣細(xì)胞簇(enriched β-clusters，eBC)從而在體外獲得功能性胰島β細(xì)胞，在治療糖尿病方面取得了重大進(jìn)展。

以類似的方式，在hESC分化成定形內(nèi)胚層后還可以進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞[67]。Agarwal等[68]在實驗中發(fā)現(xiàn)，將膠原蛋白I基質(zhì)和肝分化因子(包括FGF4、BMP4、肝細(xì)胞生長因子和地塞米松)依次添加到低血清培養(yǎng)基中，可以產(chǎn)生高度穩(wěn)定的功能性肝細(xì)胞群，這些細(xì)胞能夠表達(dá)已知的成熟肝細(xì)胞特征標(biāo)志物，并發(fā)揮相應(yīng)的功能；在最新的研究中，F(xiàn)eng等[69]在體外構(gòu)建了一種可擴(kuò)展的無血清懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠通過使用人內(nèi)胚層干細(xì)胞作為前體，大規(guī)模產(chǎn)生功能性可移植肝細(xì)胞，極大程度上滿足了肝細(xì)胞不斷增長的治療和藥物需求。

hESC分化的另一個目標(biāo)是肺泡上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞可用于肺部慢性呼吸系統(tǒng)疾病的研究和治療。Wang等[70-71]使用表面活性蛋白C啟動子控制的新霉素轉(zhuǎn)基因非病毒轉(zhuǎn)染hESC，并獲得了幾乎純凈的肺泡上皮細(xì)胞，在hESC誘導(dǎo)分化為肺泡上皮細(xì)胞群方面取得了顯著成功；此外，Strikoudis等[72]在體外使用hESC產(chǎn)生的肺類器官模擬肺纖維化并探究了肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，這為探究纖維化肺病的治療方法提供了理論依據(jù)。

2.1.2 hESC誘導(dǎo)分化的中胚層細(xì)胞

中胚層衍生的細(xì)胞已經(jīng)成功被科學(xué)家獲得，研究發(fā)現(xiàn)hESC直接誘導(dǎo)分化為中胚層需要激活TGFβ信號傳導(dǎo)通路，而這需要通過逐步添加激活素A、BMP4和生長因子(如血管內(nèi)皮生長因子和bFGF等)得以實現(xiàn)[73]。還有研究發(fā)現(xiàn)可以使hESC首先自發(fā)分化為EB進(jìn)而獲得各種中胚層衍生物：隨著EB的形成，研究人員在無血清條件下實現(xiàn)了hESC向造血譜系細(xì)胞的有效分化，其可產(chǎn)生幾乎所有類型的血細(xì)胞和免疫細(xì)胞[74]。Chadwick等[75]提出通過在無血清培養(yǎng)基中添加白介素3、白介素6以及BMP4等細(xì)胞因子可以促進(jìn)EB形成后hESC分化為造血細(xì)胞；Montel-Hagen及其同事也開發(fā)了一種用于誘導(dǎo)干細(xì)胞衍生的中胚層分化為幼稚T細(xì)胞的3D類器官系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)通過該方法得到的T細(xì)胞在體內(nèi)外均可顯現(xiàn)出抗腫瘤效果[76]。因此，hESC分化的造血譜系細(xì)胞有望改善需要血細(xì)胞移植的現(xiàn)有療法并通過細(xì)胞移植的方法治療免疫缺陷等疾病。

另一種中胚層衍生物心肌細(xì)胞已經(jīng)可以通過一些方法從hESC分化而來[77]。Laflamme等[78]研究發(fā)現(xiàn)，使用激活素A和BMP4處理致密單層hESCs，可以使其定向分化為心肌細(xì)胞；更重要的是當(dāng)研究人員將這些細(xì)胞移植到心臟受損的大鼠體內(nèi)后，其可形成功能性心肌細(xì)胞并改善受損心臟的功能。另一項研究則使用了額外的培養(yǎng)基補充劑(如VEGF、DKK1以及bFGF等)，以促進(jìn)EB向心肌細(xì)胞的分化[79]。隨著研究的深入，Bargehr等[80]還測試了hESC分化的心外膜細(xì)胞在體外增強(qiáng)心臟組織結(jié)構(gòu)和功能的能力，他們發(fā)現(xiàn)如果將hESC分化的心外膜細(xì)胞和心肌細(xì)胞共同移植至動物體內(nèi)，心肌細(xì)胞的增殖速率加倍，心臟移植物尺寸增加，收縮功能也能夠得到有效改善，從而更加有助于心臟病患者的治療。

上文提到將hESC移植到小鼠體內(nèi)可能會形成畸胎瘤，研究人員從中得到啟示，認(rèn)為hESC也可以是結(jié)締組織(骨和軟骨等)替代療法的有效細(xì)胞來源。研究人員利用3D培養(yǎng)系統(tǒng)將hESC和BMP2在高密度環(huán)境下共同培養(yǎng)從而誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞[81]；Wang等[82]也通過實驗證明了當(dāng)使用無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)hESC產(chǎn)生軟骨細(xì)胞時，用BMP2替代BMP4能夠使軟骨形成基因SOX5的表達(dá)增加并且更好地驅(qū)動hESC分化為軟骨細(xì)胞，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞聚集體的形成。通過定向培養(yǎng)hESC所得到的這些細(xì)胞可用于治療關(guān)節(jié)中軟骨破壞或骨密度低下所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎等疾病。

2.1.3 hESC誘導(dǎo)分化的外胚層細(xì)胞

在hESCs的培養(yǎng)中，最主要的分化途徑是形成外胚層進(jìn)而分化為各種神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，hESC可以被誘導(dǎo)分化為感覺神經(jīng)元[83]、多巴胺能神經(jīng)元[84]、GABA能神經(jīng)元[85]、膽堿能神經(jīng)元[86]、運動神經(jīng)元[87]以及少突膠質(zhì)細(xì)胞[88]等眾多神經(jīng)系統(tǒng)組分并參與各種神經(jīng)退行性疾病的治療(表1)。

表1 hESC分化的神經(jīng)細(xì)胞類型及臨床功能

在得到第一個hESC株系后不久，Reubinoff等[14]在體外高密度培養(yǎng)4～7周的hESCs中發(fā)現(xiàn)了可擴(kuò)增的神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cell，NPC)。研究人員將其放置于無血清培養(yǎng)基中作為神經(jīng)球體擴(kuò)增，然后通過把球體鋪在涂有聚-D-賴氨酸和層粘連蛋白的蓋玻片上成功實現(xiàn)了神經(jīng)誘導(dǎo)。結(jié)果顯示：培養(yǎng)基中出現(xiàn)了表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物β-微管蛋白和MAP2的細(xì)胞；Reubinoff及其同事還通過添加B27補充劑、人重組表皮因子EGF和bFGF來促進(jìn)NPC的擴(kuò)增，而擴(kuò)增的NPC能夠在體外以及移植到小鼠體內(nèi)后分化為主要的神經(jīng)譜系——神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[91]。與此同時，Zhang等[92]使用了一種不同的方法將hESC誘導(dǎo)分化為NPC，在該研究中，研究人員使用胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮、肝素和bFGF共同處理EB，使其在培養(yǎng)基中形成單層管狀玫瑰花樣神經(jīng)結(jié)構(gòu)，隨后使用分散酶進(jìn)行酶處理分離得到NPC；與Reubinoff的研究結(jié)果類似，產(chǎn)生的NPC也能夠在體內(nèi)體外形成少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和成熟神經(jīng)元。這些結(jié)果都證實了hESC衍生的NPC的分化潛能，這些細(xì)胞為將來可能用于治療多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的不同神經(jīng)元表型的選擇性分化奠定了基礎(chǔ)。

神經(jīng)玫瑰花結(jié)(neural rosettes)是NPC能夠分化成各種神經(jīng)細(xì)胞的重要標(biāo)志，因此多項研究都探索了增強(qiáng)神經(jīng)玫瑰花結(jié)形成的方法，以產(chǎn)生更多類型的神經(jīng)細(xì)胞。有研究報道，通過使用基質(zhì)細(xì)胞系培養(yǎng)hESC即可為其提供神經(jīng)誘導(dǎo)所需的外胚層信號因子，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)玫瑰花結(jié)的形成[93-94]。當(dāng)神經(jīng)玫瑰花結(jié)產(chǎn)生后，添加FGF2、EGF以及其他細(xì)胞因子可以使它分化為特定的神經(jīng)亞型。例如：來源于神經(jīng)玫瑰花結(jié)的神經(jīng)嵴干細(xì)胞可以通過添加BDNF、GDNF和dbcAMP，或在CNTF、neuregulin 1β和dbcAMP共同培養(yǎng)的條件下分化為周圍交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)元[95]。Li等[87]獲得了第一例hESC衍生的運動神經(jīng)元(motoneurons，MNs)，他們使用先前描述的方法生成NPC之后，通過向培養(yǎng)基中添加視黃酸以誘導(dǎo)其分化為MNs，Shh則促進(jìn)了有絲分裂后運動神經(jīng)元的進(jìn)一步成熟。隨著研究的深入，Du等[96]開發(fā)出了一種在短時間內(nèi)獲取高純度成熟MNs的方法，他們首先使用調(diào)節(jié)多種信號通路的小分子組合，將hESC誘導(dǎo)分化為高純度的運動神經(jīng)元祖細(xì)胞，隨后利用NOTCH抑制劑Cpd E將其引導(dǎo)為功能成熟的MNs富集群體。MNs的獲得為脊髓損傷和相關(guān)退行性疾病(如ALS等)的細(xì)胞替代療法提供了細(xì)胞來源。此外，實驗人員在對ALS疾病模型的研究中還發(fā)現(xiàn)非神經(jīng)元細(xì)胞，如少突膠質(zhì)細(xì)胞和施旺細(xì)胞的缺失也是ALS的發(fā)病原因之一[97]。因此他們將hESC體外分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞并移植至脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，移植到體內(nèi)的少突膠質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)運動神經(jīng)元的髓鞘再生進(jìn)而恢復(fù)其運動功能[88,98]。

除了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞外，hESCs衍生的外胚層還包括對人類視覺功能有著巨大貢獻(xiàn)的RPE細(xì)胞。有報道稱，RPE細(xì)胞能夠通過清除并更新視紫紅質(zhì)的光感受器外段來支持神經(jīng)視網(wǎng)膜，因此RPE細(xì)胞的喪失或功能障礙會導(dǎo)致黃斑變性——人類失明的最主要原因之一。為了誘導(dǎo)hESC分化為RPE細(xì)胞，Idelson等[99]將其放置于添加煙酰胺和激活素A的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，并成功獲得了RPE細(xì)胞；此后，研究人員將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至黃斑變性的動物模型中，發(fā)現(xiàn)它們可以表現(xiàn)出相應(yīng)的形態(tài)和功能特性以發(fā)揮挽救視力的作用。

2.2 hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元的功能研究進(jìn)展

hESCs誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元不僅能夠通過移植到患者體內(nèi)執(zhí)行功能，也可以在體外的研究中發(fā)揮其特性。

2.2.1 hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元功能特性及其移植體內(nèi)后的作用

(1)5-羥色胺能神經(jīng)元。位于后腦中縫核的5-羥色胺能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)腦功能方面起關(guān)鍵作用，它能夠參與情緒、認(rèn)知、飽腹感等多種自主神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)，且涉及多種精神疾病(如抑郁癥等)。因此，為了促進(jìn)其在體內(nèi)外的研究，越來越多的科學(xué)家致力于將hESC誘導(dǎo)分化為5-羥色胺能神經(jīng)元。Lu等[100]描述了一種通過激活WNT和Shh信號通路誘導(dǎo)hESC分化為5-羥色胺能神經(jīng)元的方法，他們首先將hESC放置于含有SB431542(TGF-β抑制劑)、DMH1(BMP抑制劑)和CHIR99021(GSK3-β抑制劑)的SDC培養(yǎng)基中使其分化成為后腦神經(jīng)干細(xì)胞；隨后用Shh和FGF4共同處理培養(yǎng)物使其腹側(cè)化并獲得5-羥色胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。

研究人員進(jìn)一步確定細(xì)胞的分化潛能，發(fā)現(xiàn)得到的神經(jīng)元能夠釋放5-羥色胺，且其他標(biāo)志物(包括FEV、SERT和LMX 1β)的表達(dá)均上調(diào)，這標(biāo)志著中樞5-羥色胺能神經(jīng)元的成功分化。為了評估神經(jīng)元的功能是否成熟，研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)第6周使用了電生理全細(xì)胞記錄對15個神經(jīng)元進(jìn)行了測試。實驗結(jié)果印證了5-羥色胺能神經(jīng)元的電生理特征：通過從-40 pA到+100 pA的電流注入可以觸發(fā)其動作電位，且當(dāng)注入電流低至+10 pA時還能夠誘發(fā)頻率與注入電流大小正相關(guān)的動作電位；在記錄的神經(jīng)元中，80%都出現(xiàn)了興奮性(向下)及抑制性(向上)突觸后自發(fā)電流，這表明其能夠與周圍神經(jīng)元形成功能性突觸網(wǎng)絡(luò)。此外，5-羥色胺能神經(jīng)元還顯示出自發(fā)動作電位尖峰低，具有亞閾值振蕩電位，且神經(jīng)元在大動作電位和超極化后，超極化持續(xù)時間長的特性[100][圖2(a)]。

(2)膽堿能神經(jīng)元。有關(guān)hESC分化為膽堿能神經(jīng)元(BFCN)的研究有助于探索與學(xué)習(xí)記憶障礙相關(guān)疾病(如AD)的發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞治療。Liu等[101]使用了一種新的策略。他們首先將hESC在體外分化為原始神經(jīng)上皮細(xì)胞，隨后在培養(yǎng)基中加入Shh并持續(xù)培養(yǎng)一周，從而引導(dǎo)其生成內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(MGE)祖細(xì)胞。在這個過程中，F(xiàn)OXG1表達(dá)的增加是MGE祖細(xì)胞成功分化的重要標(biāo)志；在獲得MGE祖細(xì)胞后，研究人員將它們鋪在hESC衍生的星形膠質(zhì)細(xì)胞上并加入神經(jīng)生長因子、cAMP及BDNF共同培養(yǎng)，一段時間后，所有神經(jīng)元均表達(dá)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、NKX2.1、以及囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運蛋白(VAChT)，標(biāo)志著成熟BFCN的產(chǎn)生。

研究人員使用全細(xì)胞膜片鉗記錄了分化8～10周的神經(jīng)元以確定其電生理特性，結(jié)果顯示神經(jīng)元在+20 pA至+80 pA電流注入下能夠誘導(dǎo)動作電位，并且除了具有正常的膜特性外，還具有內(nèi)向Na+和外向K+電流以及能夠觀察到自發(fā)突觸電流的特征[圖2(b)]。

為了探究hESC衍生的神經(jīng)元在體內(nèi)能否發(fā)揮功能及其機(jī)制，Liu的實驗團(tuán)隊將分化的MGE樣祖細(xì)胞移植至學(xué)習(xí)和記憶喪失的小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植后的第一周，ChAT+膽堿能神經(jīng)元很少被發(fā)現(xiàn)，然而隨著時間的推移，這些神經(jīng)元在CA3區(qū)域的錐體細(xì)胞層中的數(shù)量和細(xì)胞大小顯著增加，且能夠表達(dá)膽堿能標(biāo)記物：VAChT和人特異性突觸素等，這表明移植的膽堿能神經(jīng)元能夠和小鼠錐體神經(jīng)元之間形成突觸接觸并發(fā)揮作用；研究人員進(jìn)一步通過行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，在移植了hESC衍生的神經(jīng)元兩個月后，損傷模型小鼠在識別隱藏平臺方面開始表現(xiàn)出減少的潛伏期并且具有更好的表現(xiàn)[101]。這說明hESCs誘導(dǎo)分化的膽堿能神經(jīng)元具有改善學(xué)習(xí)、記憶和空間認(rèn)知缺陷的功能。

(3)谷氨酸能神經(jīng)元。谷氨酸能神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)元，能夠調(diào)控許多諸如睡眠和攝食等重要的人類活動。Li等[102]使用hESC在體外誘導(dǎo)分化為谷氨酸能神經(jīng)元并探究了該亞型神經(jīng)元的功能特性。首先在沒有外源形態(tài)發(fā)生素的條件下通過添加RA將hESC分化為具有背側(cè)同一性的端腦祖細(xì)胞，接著加入WNT3A培養(yǎng)基以確定它們的背側(cè)表型(GLI3的高水平表達(dá))，最后將這些細(xì)胞鋪在Neurobasal培養(yǎng)基中進(jìn)而分化為谷氨酸能神經(jīng)元。

在對獲得的谷氨酸能神經(jīng)元進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析后發(fā)現(xiàn)，分化6周的神經(jīng)元能夠表達(dá)谷氨酸能轉(zhuǎn)錄因子TBR1和CTIP2；且隨著時間的推移，在這些神經(jīng)元中可以觀察到成熟谷氨酸能神經(jīng)元標(biāo)志物——囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1(VGLUT1)的表達(dá)。隨后，研究人員還通過分化后10～12周的膜片鉗記錄分析了hESC產(chǎn)生的谷氨酸能神經(jīng)元的功能特征，結(jié)果顯示谷氨酸能神經(jīng)元在電流注入后能夠以較大的幅度和較短的持續(xù)時間激發(fā)強(qiáng)烈的動作電位[圖2(c)ⅲ]，并且在分化第10周神經(jīng)元的記錄中還偶爾觀察到了第二個動作電位；此外，在電壓鉗模式中還記錄到了內(nèi)向Na+和向外的K+電流，且內(nèi)向電流可被1 μmol/L的河豚毒素阻斷[102-103][圖2(c)ⅰ，ⅱ]。

(4)γ-氨基丁酸能(GABA)神經(jīng)元。GABA能神經(jīng)元是人腦內(nèi)最常見的中間神經(jīng)元，其通過釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸調(diào)節(jié)多種腦內(nèi)活動，具有同BFCN相似的功能，可以用于改善與學(xué)習(xí)和認(rèn)知障礙相關(guān)的疾病?；浊澳X神經(jīng)元，包括BFCN和GABA中間神經(jīng)元，起源于端腦腹側(cè)部分的MGE和視前區(qū)(POa)，因此將hESC誘導(dǎo)分化為GABA能神經(jīng)元的最初步驟與BFCN相同[101]。Liu等[101]在培養(yǎng)基中添加Shh從而使hESC分化為NKX2.1+的POa祖細(xì)胞，隨后將其鋪在星形膠質(zhì)細(xì)胞上并加入神經(jīng)生長因子持續(xù)培養(yǎng)一段時間，即分化為成熟的GABA能中間神經(jīng)元。

研究發(fā)現(xiàn)，GABA能神經(jīng)元能夠釋放GABA且表達(dá)DARPP32(投射GABA能神經(jīng)元的標(biāo)記物)和GAD65(GABA能神經(jīng)元的另一種標(biāo)記)，因此這可以作為hESC成功分化為GABA能神經(jīng)元的重要標(biāo)志。在另一項研究當(dāng)中，研究人員使用電生理膜片鉗技術(shù)揭示了GABA能神經(jīng)元的電生理活性：具有自發(fā)的動作電位[圖2(d)ⅰ]，通常顯示為“bursting”模式，且當(dāng)使用荷包牡丹堿時，GABA受體活性被消除，突觸活動被阻斷；此外，與谷氨酸能神經(jīng)元相比，GABA能神經(jīng)元具有更窄的峰值和更尖銳的復(fù)極化的特點[101,103][圖2(d)ⅱ]。

在體外實驗基礎(chǔ)的上，Liu等[101]將神經(jīng)祖細(xì)胞移植到內(nèi)側(cè)隔膜損傷進(jìn)而導(dǎo)致海馬GABA能神經(jīng)元去神經(jīng)支配的小鼠體內(nèi)6個月后，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)分化的神經(jīng)元群體主要為GABA能神經(jīng)元，且這些神經(jīng)元被細(xì)胞體和纖維中的vGLU+斑點包圍，表明移植體內(nèi)的GABA能神經(jīng)元與潛在的谷氨酸能神經(jīng)元建立了聯(lián)系并被整合到了局部神經(jīng)回路中。與此同時，在評估神經(jīng)元移植前后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的實驗中，研究人員證實，移植的GABA能神經(jīng)元能夠改善小鼠的學(xué)習(xí)能力，有助于功能恢復(fù)。

(5)多巴胺能神經(jīng)元。hESC衍生的中腦多巴胺能(DA)神經(jīng)元能夠為PD的細(xì)胞替代療法提供無限細(xì)胞來源。Kawasaki等[105]發(fā)現(xiàn)某些小鼠基質(zhì)細(xì)胞系具有促進(jìn)小鼠ESC神經(jīng)發(fā)生的能力，進(jìn)而誘導(dǎo)其分化為中腦多巴胺能(DA)神經(jīng)元。除了經(jīng)過充分研究的常規(guī)DA神經(jīng)元外，Lammel等[104]還在實驗中發(fā)現(xiàn)了DA神經(jīng)元的非典型快速放電亞型，兩種神經(jīng)元具有不同的分子和功能特性。他們將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為DA神經(jīng)元，隨后對神經(jīng)元進(jìn)行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都能夠表達(dá)重要的DA標(biāo)記基因酪氨酸羥化酶(TH)和質(zhì)膜多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白(DAT)，而快速放電亞型的DA神經(jīng)元卻對DAT的表達(dá)非常低。研究人員利用全細(xì)胞和穿孔膜片鉗技術(shù)記錄了體外腦切片從而確定這兩種不同DA神經(jīng)元的基本電生理特性。研究發(fā)現(xiàn)，在電流鉗模式下，紋狀體DA神經(jīng)元具有緩慢的規(guī)則放電、典型的低閾值、寬動作電位(AP)和顯著的后超極化(AHP)等特點[圖 2(e)ⅰ]；而皮層DA神經(jīng)元相較于傳統(tǒng)的紋狀體DA神經(jīng)元，則表現(xiàn)出更快的自發(fā)放電頻率、更長的AP持續(xù)時間以及沒有AHP的寬AP波形和下垂組件的特性[圖2(e)ⅱ]。

(a)用電生理學(xué)測定5-羥色胺能神經(jīng)元(左圖神經(jīng)元自發(fā)動作電位尖峰低；右圖神經(jīng)元在AP和AHP后，AHP的持續(xù)時間較長)。(b)膽堿能神經(jīng)元的電生理特性(ⅰ通過電流注入誘導(dǎo)的動作電位；ⅱ在電壓階躍下觸發(fā)的內(nèi)向和外向電流；ⅲ記錄到的自發(fā)突觸電流)。(c)谷氨酸能神經(jīng)元的電生理特性[ⅰ在神經(jīng)元中注射20 pA電流時引發(fā)動作電位；ⅱ電壓階躍(-50 mV至50 mV)會引發(fā)內(nèi)向和外向電流，且1 μmol/L河豚毒素能夠消除Na+電流(箭頭)；ⅲ左圖在2 s、470 nm光刺激期間細(xì)胞的電流鉗記錄；中圖AP的平均頻率(n=7)；右圖電流鉗記錄通過清晰的閾值偏轉(zhuǎn)(箭頭)顯示了動作電位的存在]。(d)GABA能神經(jīng)元的特性[ⅰ左圖GABA能神經(jīng)元的神經(jīng)生物素染色(紅色)；中、右圖神經(jīng)元中的自發(fā)動作電位；ⅱ GABA能神經(jīng)元與谷氨酸能神經(jīng)元動作電位的差異]。(e)兩種不同功能表型的中腦多巴胺能神經(jīng)元的電生理特性[ⅰ左圖電流鉗模式下，紋狀體DA神經(jīng)元放電緩慢有序且具有明顯的后超極化；右圖典型的AP波形及其相位圖(mVms-1/mV)；ⅱ左圖電流鉗模式下，皮層DA神經(jīng)元快速放電且無AHP；右圖顯示了沒有AHP的寬AP波形，且與ⅰ相比幅度較小以及具有較小最大去極化和復(fù)極化速度的AP的相位圖(mVms-1/mV)]

在最新研究中，Chen等[106]將經(jīng)過編程表達(dá)DREADDs系統(tǒng)(designer receptors exclusively activated by designer drugs，只由特定藥物激活的受體)的DA神經(jīng)元前體細(xì)胞移植到PD模型小鼠的紋狀體內(nèi)，通過特定激活該系統(tǒng)的藥物CNO控制所移植細(xì)胞的激活，進(jìn)而可以規(guī)避由于移植數(shù)量不可控所造成的功能影響(圖3)。在此研究的基礎(chǔ)上，Xiong等[107]進(jìn)一步將hESC分化的DA神經(jīng)前體細(xì)胞移植到PD小鼠受損的黑質(zhì)腦區(qū)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的DA神經(jīng)元能夠長出大量神經(jīng)纖維并與紋狀體細(xì)胞形成神經(jīng)連接，其重建的黑質(zhì)-紋狀體神經(jīng)連接在結(jié)構(gòu)和功能上都與內(nèi)源神經(jīng)連接高度一致，從而有助于對PD的治療作用。

圖3 可控hESCs誘導(dǎo)分化的DA能神經(jīng)元移植

2.2.2 hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元在體外研究中的功能

(1)單細(xì)胞層面。hESC衍生的神經(jīng)元還可以作為各種體外研究的原材料以發(fā)揮其功能，如確定某種神經(jīng)元的功能特性從而加強(qiáng)對它們的認(rèn)識、探討某些因子對神經(jīng)細(xì)胞的作用和機(jī)制以及研究神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系以探究人類大腦早期發(fā)育過程等。

hESCs分化的各種神經(jīng)元能夠為體外確定某種因子或病毒對機(jī)體影響的研究提供便捷的工具。研究發(fā)現(xiàn)，雙酚A(BPA)由于能通過血腦屏障，與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)；科學(xué)家利用hESC衍生的人皮質(zhì)神經(jīng)元，將其在體外與BPA共同培養(yǎng)14 d并檢測BPA對神經(jīng)元形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)以及神經(jīng)標(biāo)志物的影響從而評估BPA對人體不利的神經(jīng)毒性作用及機(jī)制[108]。此外，還有研究人員為更深入了解水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，在體外比較了hESC衍生的神經(jīng)元和MRC-5細(xì)胞內(nèi)VZV的感染性、生長特性及病毒形態(tài)等，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元被感染性更高，且在研究VZV的發(fā)病機(jī)理和獲得高滴度病毒儲備方面更具優(yōu)勢[109]。

hESC誘導(dǎo)分化的各種類型神經(jīng)元還可在體外被用于確定自身功能特性并優(yōu)化其分化策略。例如：Young等[83]使用群體和單細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合的方法對來自hESC的感覺神經(jīng)元進(jìn)行了詳細(xì)分析，進(jìn)而確定了這類細(xì)胞特殊的功能并由此優(yōu)化了感覺神經(jīng)元的分化方案。在實驗中研究人員首先對干細(xì)胞分化過程中5個時間點的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞qPCR，記錄其基因表達(dá)變化并評估了培養(yǎng)物中細(xì)胞的同質(zhì)性；隨后利用膜片鉗和藥理學(xué)等相關(guān)技術(shù)確定了分化的感覺神經(jīng)元所表達(dá)的離子通道亞單位以及其產(chǎn)生動作電位的性質(zhì)[83]。實驗結(jié)果首次證明了體外細(xì)胞和人體背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的相似性，為疼痛生物學(xué)的研究開辟了前景。

除了能夠確定神經(jīng)元的功能之外，研究人員還可以在單個神經(jīng)元水平上研究hESCs衍生的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中同步活動的出現(xiàn)從而探索早期發(fā)育大腦電活動的形成過程。大腦通過電活動執(zhí)行認(rèn)知功能，這是由單個神經(jīng)元之間相互交流產(chǎn)生的，然而異步神經(jīng)元之間是如何引起神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的同步活動卻不清楚，hESC的出現(xiàn)使研究人員可以更方便地在體外研究這一過程。M?kinen等[110]將hESCs衍生的神經(jīng)元在體外進(jìn)行培養(yǎng)，在其自發(fā)形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過程中添加GABA激動劑和拮抗劑等藥物，并在單神經(jīng)元分辨率下用鈣成像和微電極陣列(MEAs)測量各神經(jīng)元活動及其相互間的交流情況，通過比較記錄的結(jié)果并采用大規(guī)模單細(xì)胞分析，將單神經(jīng)元反應(yīng)與網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)聯(lián)系起來；研究人員展示了單細(xì)胞分布是如何引起GABA及GABA受體激動劑的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，并證明了最早形式的同步神經(jīng)元活動是依賴于GABA誘導(dǎo)的去極化減少，而不由內(nèi)源性GABA介導(dǎo)。

(2)突觸傳遞及神經(jīng)回路層面。除了能夠利用hESC分化的神經(jīng)元在單細(xì)胞層面進(jìn)行研究之外，本課題組還使用hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元在體外成功模擬了神經(jīng)皮質(zhì)回路并應(yīng)用于研究當(dāng)中，開創(chuàng)了hESC衍生物在突觸傳遞和神經(jīng)回路層面的功能突破[103]。

研究發(fā)現(xiàn)，學(xué)習(xí)和記憶是通過改變同時活躍的神經(jīng)元之間的突觸強(qiáng)度而形成的心理活動[111]，通過腦片分析可以得出其電生理學(xué)基礎(chǔ)是長時程增強(qiáng)(LTP)和長時程抑制(LTD)，這依賴于突觸可塑性[112-113]；具體的生理化學(xué)過程是通過激活A(yù)MPA受體以及突觸后的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，從而導(dǎo)致鈣濃度升高以激活蛋白激酶C等細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終改變突觸效應(yīng)。在以往的研究中，LTP和LTD在手術(shù)切除的腦組織中被發(fā)現(xiàn)過[114-115]，并且也可以通過人類聽覺誘發(fā)電位的長期增加以及視覺棋盤誘導(dǎo)的視覺誘發(fā)電位的快速重復(fù)呈現(xiàn)間接被觀察到[116-117]；然而這是非常少見的現(xiàn)象，很難進(jìn)行機(jī)制研究，并且由于取材的限制，人類腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實驗難以全面深入研究，在體外想要分析人類生理和病理條件下神經(jīng)可塑性的變化不容易實現(xiàn)。鑒于大量hESC的可用性，課題組利用hESCs誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元在體外設(shè)計了一種便捷且通用的模型，用于評估人類神經(jīng)可塑性。

將hESC在Shh拮抗劑環(huán)巴胺的存在下誘導(dǎo)分化為可表達(dá)光敏感通道蛋白(ChR2)的谷氨酸能神經(jīng)元，并與hESC衍生的GABA能神經(jīng)元在培養(yǎng)基中按照2∶ 1的比例共培養(yǎng)，在體外模擬皮質(zhì)回路[118](圖4)。隨后使用藍(lán)光對培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行刺激，在藍(lán)光刺激下(2 s，470 nm，0.4 mW/mm2)，谷氨酸能神經(jīng)元產(chǎn)生了強(qiáng)動作電位，且引發(fā)內(nèi)向電流，為使記錄的結(jié)果完全是通過ChR2所誘導(dǎo)的電流，使用1 μmol/L的河豚毒素處理神經(jīng)元以消除其他作用電流；接著評估谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元之間的突觸相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于光刺激之前，光刺激谷氨酸能神經(jīng)元可以使GABA能神經(jīng)元的興奮性突觸后電流(EPSCs)的平均頻率顯著增加，并且光刺激可以增加突觸前谷氨酸能神經(jīng)元向GABA能神經(jīng)元釋放的谷氨酸數(shù)量從而對突觸前末端有促進(jìn)作用。

圖4 hESCs分化的谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元在體外共培養(yǎng)[103]

通過光刺激能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間的突觸傳遞，實驗中分別使用了重復(fù)光照(刺激時間 200 ms)和低頻(900脈沖，3 Hz)藍(lán)光刺激表達(dá)ChR2的谷氨酸能神經(jīng)元，并同時記錄不表達(dá)ChR2的GABA能神經(jīng)元的eEPSCs。結(jié)果顯示在使用重復(fù)光照刺激谷氨酸能神經(jīng)元時，GABA能神經(jīng)元eEPSC的振幅和mEPSC的頻率都顯著增加；而通過低頻光刺激神經(jīng)元時，EPSCs的幅度和頻率則顯著下降，表明實驗中出現(xiàn)了類似LTP[圖5(a)]和LTD[圖5(b)]的行為。我們的研究不僅首次發(fā)現(xiàn)了構(gòu)建具有學(xué)習(xí)記憶功能的人類體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法，還進(jìn)一步采用光遺傳和特殊的光刺激程序創(chuàng)造性地解決了體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中無法尋找神經(jīng)回路的難題，為研究人類學(xué)習(xí)和記憶以及建立電路學(xué)習(xí)和記憶的計算模型提供了研究平臺。

(a)重復(fù)光刺激前后GABA能神經(jīng)元中eEPSC的變化；(b)低頻光刺激前后GABA能神經(jīng)元EPSC的幅度變化

3 hESC的挑戰(zhàn)與展望

hESC誘導(dǎo)分化的各種細(xì)胞在癌癥、帕金森病、阿爾茨海默病及糖尿病等各種疾病的治療中具有巨大的潛力，并且還能夠應(yīng)用于多種體外研究中，為不同領(lǐng)域提供新的思路和工具。然而這其中依然存在很多問題和挑戰(zhàn)：盡管體內(nèi)體外研究表明，在未來有希望利用hESC治療多種疾病，但這首先取決于分化的成熟功能性細(xì)胞的數(shù)量和可用性，近年來無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系逐漸成為主流，然而使用2D培養(yǎng)存在一些局限性，大多數(shù)2D培養(yǎng)的hESC在細(xì)胞移植后立即死亡，并且存活下來的細(xì)胞也不能起到修復(fù)組織的作用，因此為了獲得成熟的功能性細(xì)胞，需要研究人員嘗試建立更加成熟和簡便的3D培養(yǎng)系統(tǒng)。其次，還需避免移植細(xì)胞在發(fā)揮其治療作用之外引起免疫排斥以及形成腫瘤，與創(chuàng)傷形成和免疫排斥有關(guān)的問題也是hESC成功應(yīng)用的瓶頸，雖然這可以通過沉默觸發(fā)腫瘤形成和免疫排斥的基因、分子途徑或使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來實現(xiàn)，但仍然需要研究人員進(jìn)一步探索。最后，在hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞功能方面仍有大量的問題有待研究。

展望未來，與生物工具平行的工程方法也應(yīng)被納入到包括人類在內(nèi)的哺乳動物的研究當(dāng)中，用于設(shè)計、分析和操縱生物過程。例如，使用合成Notch受體設(shè)計細(xì)胞的定制傳感和響應(yīng)行為以及使用組合抗原傳感電路精確識別腫瘤等合成生物學(xué)的應(yīng)用[118-120]；還有hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元利用CRISPR和光遺傳等方法在體外成功構(gòu)建具有學(xué)習(xí)和記憶功能的人類神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，為建立電路學(xué)習(xí)和記憶的計算模型提供新方法等[103]。應(yīng)該更多地將工程方法與hESC相結(jié)合，實現(xiàn)將人類生物學(xué)的基本知識轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用的夢想。