范 珺

（濰坊市檢驗檢測中心，山東濰坊 261000）

1 前言

磺胺類藥物自發(fā)現(xiàn)至今，已有80余年歷史。由于其具有廣譜抗菌性、性質穩(wěn)定、吸收快、使用方便等諸多優(yōu)點，使其在醫(yī)療衛(wèi)生、食品生產(chǎn)、動物養(yǎng)殖等領域應用廣泛。但在使用過程中也存在著一些缺陷，例如抑菌效果弱、易產(chǎn)生耐藥性、用量大、療程長和發(fā)生不良反應等，這些缺陷的存在會造成磺胺類藥物的過量使用，由此導致水產(chǎn)、畜禽肉等農(nóng)產(chǎn)品中藥物殘留超標，對人體健康產(chǎn)生威脅。

隨著檢驗檢測技術的發(fā)展，關于磺胺類藥物的檢測方法已從最初的一種變?yōu)楝F(xiàn)在的多種，主要包括LC-MS（高效液相-串聯(lián)質譜法）、LC（高效液相色譜法）、快速檢測法（ELISA酶聯(lián)免疫吸附法）、安培檢測法等。其中LC-MS和LC最為常用，在定性定量方面占有很大優(yōu)勢。本研究以水產(chǎn)品為檢測對象，經(jīng)過一系列條件的優(yōu)化，建立了關于磺胺類藥物的高效液相-串聯(lián)質譜法的檢測方法。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與儀器

甲酸（色譜純，賽默飛世爾），甲醇、乙腈（色譜純，默克），Captive EMR柱（5982-1003，安捷倫），7種磺胺類藥物的混合標準品（100μg/ml，Dr.Ehrenstorfer GmbH）。0.1%甲酸-水溶液：甲酸：水=1：1000。

超高效液相色譜（1290）-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀（6495）（美國，安捷倫）；CF16RN高速冷凍離心機（日本，日立）；渦旋混合器（德國，IKA）；MS2204TS電子天平（瑞士，梅特勒）。

樣品為市售魚類，取可食部分進行均勻碎樣作為待測樣品。

2.2 標準溶液的配制

準確量取0.1mL的100μg/mL磺胺類藥物混合標準品于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，得到濃度為1ug/mL的混合標準品儲備溶液，冷藏保存。

準確量取1mL標準品儲備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容后得到濃度為100ng/mL的混標標準品工作液，冷藏保存。分別吸取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL的上述工作液于10mL容量瓶中，用初始流動相定容，即得到濃度分別為1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列工作液。

2.3 樣品前處理

待測樣品經(jīng)充分均質后，稱取5.0g于離心管中，加入2ml水以3000r/min轉速渦旋1min。然后加入10mL乙腈，4.0g無水硫酸鈉和1.0g氯化鈉，劇烈震蕩1min，靜置10min，于4℃以9000r/min轉速離心10min。取出2.4mL上清液，加0.6mL水，以2000r/min轉速渦旋1min，混合液過Captive EMR柱，重力自流。收集流出液過0.22μm有機濾膜，作為待測樣液。

2.4 儀器條件

2.4.1 超高效液相色譜條件。色譜柱：ZORBAX SB-C18（3.0×100mm，1.8-Micron）；柱溫：35℃；進樣體積：2μL；流速：0.4mL/min。流動相組成：A 為0.1%甲酸-水溶液，B純甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 質譜條件

離子源：AJS ESI源；離子模式：正離子模式；毛細管電壓：3500V；噴嘴電壓：0V；霧化氣壓力：30psi；干燥氣溫度：150℃；干燥氣流速：15L/min；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；監(jiān)測模式：MRM模式（多反應監(jiān)測）。待測磺胺類藥物的具體離子參數(shù)見表2。

表2 7種磺胺類藥物的MRM采集參數(shù)

3 結果與分析

3.1 建立標準曲線

對目標化合物進行定量的依據(jù)是建立標準曲線，將事先配置好的一系列工作液按相同的儀器條件進行上機測定，利用得到的響應值和對應的溶液濃度即可建立線性方程。依照1.4中設定的儀器條件進行磺胺類藥物標準曲線的建立，各目標物的線性方程和相關系數(shù)R2見表3。標準溶液的磺胺類藥物MRM色譜圖見圖1。

圖1 2ng/mL標準溶液中7種磺胺類藥物的MRM色譜圖

從表3可知，由安捷倫液質聯(lián)用儀建立的各磺胺類藥物的標準曲線具有良好線性，相關系數(shù)R2在0.9981～0.9999之間，說明建立的儀器條件和采集方法是合適的，可以準確對目標化合物進行定量測定。并且各化合物的出峰時間相差較大，峰形沒有重疊（見圖1），說明色譜柱分離效果好，可以將磺胺類混合物完全分開，使定性定量更加準確。

方法檢出限指分析方法在適當置信水平內，能從樣品中檢測被測組分的最小量或最小濃度，是表征分析方法的重要參數(shù)之一。表3顯示7種磺胺類藥物的檢出限低至1.0ug/kg，可見建立的前處理方法和檢測方法具有很高的靈敏度，對于檢測水產(chǎn)品中的磺胺來說有效可行。

表3 7種磺胺類藥物殘留的線性方程和儀器檢出限

3.2 方法回收率的確定

樣品經(jīng)過前處理后，待分析物質通常會發(fā)生損失。為了檢驗樣品處理方法的適宜性和人員操作誤差等因素，需要在實驗過程中設置質控樣品用來監(jiān)控實驗結果的準確度，回收率計算是一種常用的有效方法。

稱取5.0g樣品，加入25uL 1ug/mL的混標標準品儲備液，使其添加水平為5ug/kg。待與樣品充分混勻后，按照和空白樣品相同的處理過程進行，用得到的提取液上機測定，其回收率見表4。

表4 實驗添加水平下7種磺胺類藥物的回收率

從表4可知，在5ug/kg的添加水平下，7種磺胺類藥物的回收率范圍為83%～95%，其中磺胺嘧啶的加標回收率最低，為83.4%；磺胺喹惡啉的加標回收率最高，為94.2%；其余磺胺化合物的回收率處于兩者之間。由于樣品自身含有的7種磺胺類藥物含量均低于檢出限1ug/kg，根據(jù)GB/T27404-2008標準中對回收率的要求，當被測組分的含量小于0.1mg/kg時，回收率在60%～120%之間即為合格，由此可以判定實驗所用的前處理方法完全可以滿足檢測要求。

4 結論

本文以水產(chǎn)品為檢測樣品，利用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定了其含有的7種磺胺類化合物的含量。利用本實驗建立的測定方法可以在1ng/mL～20ng/mL范圍內呈良好線性關系，7種磺胺藥物的相關系數(shù)均大于0.998，說明本方法可以準確定量水產(chǎn)品中的該類藥物。同時該方法的檢出限為1ug/kg，該檢出限表明本方法可以用于水產(chǎn)品中痕量級別的磺胺類藥物殘留檢測，具有更高的檢測靈敏度，對于保證產(chǎn)品安全十分有效。除此之外，本實驗還驗證了添加水平為5ug/kg時該方法的回收率，結果顯示各類藥物的回收率均大于80%，說明該方法準確穩(wěn)定，可以滿足檢測要求。LC-MS方法的建立有助于提高實驗室的檢測效率和檢測水平，嚴格把控水產(chǎn)品類食品的質量安全，保證消費者權益。