胡代花，楊旭，陳旺，馮自立，張嘉昕，李翠麗，隋香菊，祁珊珊*，雒志恒

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性骨骼疾病，主要特征為低骨量和骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)退變，易導(dǎo)致骨脆性增加和骨折的發(fā)生。婦女絕經(jīng)后因卵巢功能衰退，血液及組織內(nèi)的雌激素水平大幅降低，破骨細(xì)胞活躍程度增強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)化率加快，骨吸收大于骨形成，引發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，PMOP發(fā)病率高達(dá)60%～70%，嚴(yán)重威脅患者的健康和生活質(zhì)量[1-3]。

維生素D2（VD2）作為維生素D家族的重要一員，與維生素D3（VD3）具有相近的生物功能，均能調(diào)節(jié)鈣磷的代謝，促進(jìn)骨骼的健康，在臨床上用于預(yù)防和治療佝僂病、骨質(zhì)軟化、骨質(zhì)疏松等疾病[4-6]。人體自身不能合成VD2，需通過(guò)食物補(bǔ)充。高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食用菌中不含VD2或含量極低，但卻含有較高的VD2前體——麥角甾醇[7-8]。在紫外照射下，食用菌中麥角甾醇發(fā)生B環(huán)開(kāi)環(huán)生成VD2前體，再經(jīng)1，7-氫遷移和重排周環(huán)反應(yīng)生成VD2。食用菌通過(guò)紫外輻照處理，其VD2含量大幅度提高[10-18]，可作為補(bǔ)充VD的食品及藥品的重要天然原料。關(guān)于高含量VD2食用菌的體內(nèi)生物利用率，文獻(xiàn)多對(duì)正常大鼠或缺乏VD人群補(bǔ)充不同劑量的紫外照射食用菌，從血清Ca2+濃度、25-羥基-VD2含量、甲狀旁腺激素表達(dá)水平、股骨密度、脛骨厚度、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)基因在十二指腸和腎臟中的表達(dá)等指標(biāo)進(jìn)行研究，結(jié)果表明通過(guò)紫外照射提高VD2含量的食用菌具有較好的生物利用度[19-24]，但有關(guān)其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療效果尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

為了進(jìn)一步明確高含量VD2食用菌對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療效果，本文以去雙側(cè)卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為模型，以所研制的金針菇源VD2復(fù)合片劑為材料，比較大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，StrACP）等生化指標(biāo)及臟器指數(shù)、子宮和骨組織等形態(tài)病理學(xué)指標(biāo)變化，旨在為食用菌源VD2產(chǎn)品的研發(fā)及高值化應(yīng)用，以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和重要參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Nikon Ti倒置熒光顯微鏡：尼康光學(xué)儀器有限公司；BIOTEK EPOCH酶標(biāo)儀：美國(guó)博騰儀器有限公司；1200紫外分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；RM2235石蠟組織切片機(jī)：萊卡顯微系統(tǒng)有限公司；YT-7C攤烤片機(jī)：孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司；5424型低速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf有限公司；ZNCL-BS磁力攪拌器：常州梅香儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平：賽多利斯儀器有限公司；DHP-200電熱恒溫培養(yǎng)箱：河北大宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

VD2滴丸：國(guó)藥控股星鯊制藥有限公司；金針菇源VD2復(fù)合片劑：陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所自制；微板法鈣試劑盒、磷鉬酸法磷測(cè)試盒、堿性磷酸酶試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性3月齡未孕SD大鼠24只，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重210 g～258 g，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 雙側(cè)卵巢去除手術(shù)

將24只SD大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）和去卵巢組（OVX組），其中Sham組6只，OVX組18只。OVX組大鼠參考文獻(xiàn)方法實(shí)施卵巢去除手術(shù)[25-26]。Sham組大鼠實(shí)施假手術(shù)，術(shù)后1周對(duì)OVX組大鼠進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)5 d，觀察去卵巢組不出現(xiàn)動(dòng)情周期，表明卵巢去除成功。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

手術(shù)后1周，對(duì)OVX組進(jìn)行分組，分別是OVX+市售 VD2組（OVX+VD2組）、OVX+金針菇源 VD2復(fù)合片劑組（OVX+MVHP組）和OVX組，每組6只。其中Sham組每只大鼠每次灌胃1 mL純花生油；OVX組每只大鼠每次灌胃1 mL純花生油；OVX+VD2組每只大鼠每次灌胃含市售VD2滴劑的花生油（15 IU/mL）1 mL；OVX+MVHP組每只大鼠每次灌胃含金針菇源VD2復(fù)合片劑的花生油（15 IU/mL）1 mL。隔天灌胃，持續(xù)給藥16周。

1.5 臟器指數(shù)測(cè)定

連續(xù)給藥16周后將大鼠處死并稱重，打開(kāi)大鼠腹腔，取出大鼠心臟、肝、脾、腎和子宮等臟器分別進(jìn)行稱重，計(jì)算各臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重/大鼠體重。

1.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定

連續(xù)給藥16周后采集大鼠眼眶靜脈血，4000r/min離心10 min，分離血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清鈣含量、血清磷含量、血清堿性磷酸酶活性、抗酒石酸酸性磷酸酶活性測(cè)定參考試劑盒方法進(jìn)行。

1.7 骨組織樣品采集及病理學(xué)分析

連續(xù)給藥16周后處死動(dòng)物，取其左側(cè)脛骨和股骨，3.7%多聚甲醛4℃固定24 h，磷酸鹽緩沖液漂洗，10%乙二胺四乙酸（pH 8.0）4℃，脫鈣21 d。將脫鈣標(biāo)本以磷酸鹽緩沖液充分漂洗，依次脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片（5 μm），蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）。顯微鏡觀察各組大鼠骨組織形態(tài)[26]。

1.8 子宮病理組織形態(tài)學(xué)觀察和形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)

取各組大鼠右側(cè)子宮角組織，依次脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片（5 μm），HE 染色。光學(xué)顯微鏡 4×10倍鏡下觀察子宮管徑厚度，10×10倍鏡下觀察子宮固有層腺體數(shù)量，40×10倍鏡下觀察子宮黏膜上皮厚度，并分別隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照保存，應(yīng)用Image Pro Plus軟件對(duì)子宮管徑厚度、子宮黏膜上皮厚度進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定[26]。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey’s HSD進(jìn)行方差分析（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清鈣和磷含量測(cè)定結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清鈣和磷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同處理組大鼠血清鈣和磷濃度（n=6）Fig.1 Serum calcium and phosphorus concentrations in rats in different treatment groups（n=6）

圖1結(jié)果表明，與OVX組相比，OVX+MVHP組血清鈣濃度顯著升高（p<0.05）。Sham 組、OVX+VD2組血清鈣濃度與OVX組、OVX+MVHP組均無(wú)顯著差異（p>0.05）；與OVX組相比，Sham組、OVX+MVHP組血清磷濃度均無(wú)顯著差異（p>0.05），而OVX+VD2組血清磷濃度顯著下降（p<0.05）。

2.2 血清AKP與StrACP活性測(cè)定結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組血清AKP與StrACP活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中AKP、StrACP測(cè)量結(jié)果（n=6）Table 1 The AKP and StrACP in rats seurm of different groups（n=6）

表1結(jié)果表明，Sham組、OVX+VD2組和OVX+MVHP組血清中AKP活性與OVX組相比均顯著降低（p<0.05），但各組血清StrACP活性與OVX組相比均無(wú)顯著差異（p>0.05）。OVX+VD2組和OVX+MVHP組血清StrACP活性與Sham組相比均顯著降低（p<0.05），但二者之間無(wú)顯著差異（p>0.05）。

2.3 臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

各組大鼠主要臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 各組大鼠臟器指數(shù)結(jié)果比較（n=6）Table 2 The major organ index of rats in different groups after operation（n=6）

與OVX組相比，OVX+MVHP組肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、子宮指數(shù)顯著升高（p<0.05），心臟指數(shù)顯著降低（p<0.05），而脾臟指數(shù)無(wú)顯著差異（p>0.05）。與OVX+VD2組相比，OVX+MVHP組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、子宮指數(shù)顯著降低（p<0.05），腎臟指數(shù)顯著升高（p<0.05），而心臟指數(shù)無(wú)顯著差異（p>0.05）。

2.4 子宮組織病理學(xué)觀察

子宮組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2所示，Sham組大鼠子宮斷面結(jié)構(gòu)在光鏡下主要呈現(xiàn)壁厚腔窄的形態(tài)，單層柱狀上皮規(guī)則排列，子宮肌層較厚，各層肌纖維相互交織，固有層分布有腺體和血管。與Sham組相比，OVX組子宮管徑厚度明顯變薄，子宮腔徑厚度也明顯增加，子宮黏膜上皮厚度明顯變小，固有層子宮腺體減少；與OVX組相比，OVX+VD2組和OVX+MVHP組子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度明顯增加，子宮腔徑厚度明顯減小，肌層和子宮內(nèi)膜顯著增厚，固有層子宮腺體增多。

圖2 子宮組織病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Histopathological observation of uterus of rats in different groups

2.5 子宮形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果

子宮組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果如表3所示。

表3 各組大鼠子宮形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果比較（n=6）Table 3 The measurements of uterine morphometric indicators in rats of different groups（n=6）

與Sham組相比，OVX組子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度顯著降低（p<0.05），子宮腔徑厚度顯著升高（p<0.05）；與OVX組相比，OVX+MVHP組子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度顯著升高（p<0.05），而子宮腔徑厚度顯著降低（p<0.05）；OVX+MVHP組與OVX+VD2組子宮管徑厚度、子宮黏膜上皮厚度及子宮腔徑厚度均無(wú)顯著差異（p>0.05）。

2.6 骨組織病理學(xué)觀察

骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖3所示。

圖3 各組大鼠脛骨和股骨病理學(xué)觀察Fig.3 Pathological observation of femora and tibia of rats in different groups

Sham組股骨的骨小梁致密且較寬、排列整齊并連接成網(wǎng)；與Sham組相比，OVX組股骨的骨小梁出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)扭曲不完整，大部分不能連接成網(wǎng)狀；與OVX組相比，OVX+MVHP組骨小梁有所恢復(fù)，骨小梁間隙變小，排列尚整齊并相互連接。Sham組脛骨骨髓腔較小，骨小梁致密且相互連接；與Sham組相比，OVX組脛骨骨髓腔變大，骨小梁松散；與OVX組相比，OVX+MVHP組骨髓腔變小，骨小梁斷裂情況改善。

3 結(jié)論與討論

切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢所致的骨質(zhì)疏松，能夠正確模擬女性由于雌激素缺乏而引起骨質(zhì)疏松的臨床特征，是學(xué)術(shù)界目前公認(rèn)的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型，亦是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本文以去雙側(cè)卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為模型，以所研制的金針菇源VD2復(fù)合片劑為材料，比較了不同處理組大鼠血清鈣、磷、AKP、StrACP等生化指標(biāo)及臟器指數(shù)、子宮和骨組織形態(tài)病理學(xué)等指標(biāo)變化，結(jié)果表明，與Sham組比較，OVX組大鼠子宮系數(shù)、組織病理學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)及骨組織病理學(xué)均有顯著差異，說(shuō)明去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。與OVX組相比，OVX+MVHP組血清鈣濃度顯著升高（p<0.05），AKP濃度顯著降低（p<0.05），而血清磷和StrACP濃度無(wú)顯著差異（p>0.05），心、肝、腎、子宮等臟器指數(shù)差異顯著（p<0.05），而脾臟無(wú)顯著差異（p>0.05）；子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度顯著升高（p<0.05），子宮腔徑厚度顯著降低（p<0.05），股骨和脛骨骨小梁致密，小梁間距和骨髓腔變小。初步表明金針菇源VD2復(fù)合片劑對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防和治療作用，研究結(jié)果為紫外照射提高VD2含量的食用菌的生物利用度，以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和重要參考。