梁山泉，劉枝浩，王敬宇，朱常亮，牟海津

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

牡蠣已在世界各地被廣泛養(yǎng)殖，在滿足人類營(yíng)養(yǎng)需求和促進(jìn)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面具有巨大價(jià)值[1]。然而，牡蠣體內(nèi)的微生物種類繁多，其中包含著副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌等致病微生物，這些致病微生物會(huì)帶來(lái)食品安全的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于牡蠣的高水分和養(yǎng)分含量可為多種微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供有利的條件，從而導(dǎo)致牡蠣易腐敗[2]。通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)和高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，東部牡蠣（Crassostrea virginica）腸道微生物以變形菌門（Proteobacteria）為主，占了所有細(xì)菌的70%以上，此外還包括疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）和厚壁菌門（Firmicutes）等[3]。太平洋牡蠣（C.gigas）體內(nèi)的微生物以假單胞菌屬為主，占三分之一以上，其它菌屬包括弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和氣單胞菌屬[4]。

牡蠣在收獲后會(huì)經(jīng)歷運(yùn)輸和儲(chǔ)存等工序，在此過(guò)程中其體內(nèi)的微生物多樣性會(huì)發(fā)生顯著的變化。因此，在消費(fèi)之前進(jìn)行有效的處理來(lái)減少牡蠣體內(nèi)微生物是有必要的。近年來(lái)，超高壓處理這種非熱加工技術(shù)在海產(chǎn)品殺菌方面的研究越來(lái)越受到關(guān)注，該技術(shù)可在不破壞海產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分的前提下[5]，有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖并滅活[6]。LOPEZ-CABALLERO等[7]報(bào)道當(dāng)牡蠣經(jīng)過(guò)400 MPa處理10 min后，大腸桿菌、產(chǎn)H2S的細(xì)菌和總活菌數(shù)可減少到檢測(cè)閾值以下。HE等[8]研究表明高靜水壓處理后的牡蠣在存儲(chǔ)過(guò)程中（3℃超過(guò)27 d）細(xì)菌總數(shù)保持在較低的水平。從260 MPa處理后的牡蠣中分離出的細(xì)菌主要是腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrifaciens）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。而經(jīng)過(guò)500 MPa或800 MPa處理的牡蠣則主要為假單胞菌屬[9]。CAO等[10]發(fā)現(xiàn)高靜水壓處理可極大地改變牡蠣在冷藏過(guò)程中腐敗菌群的組成，經(jīng)300 MPa處理2 min的變質(zhì)牡蠣中以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（42.3%）為主，而交替假單胞菌屬（32.2%）和希瓦氏菌屬（19.5%）在未經(jīng)高靜水壓處理的變質(zhì)牡蠣中占主導(dǎo)地位。在這些研究中，有關(guān)超高壓處理的大多數(shù)報(bào)道都集中在致病微生物的滅活和牡蠣整體菌群的變化。牡蠣腸道是牡蠣體內(nèi)微生物主要存在的部位之一，目前并沒(méi)有關(guān)于超高壓處理對(duì)牡蠣腸道菌群影響的報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)16S rRNA測(cè)序方法對(duì)100、200 MPa和400 MPa超高壓處理5 min的牡蠣腸道進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的分析，探究超高壓與菌群的相關(guān)性，為利用超高壓技術(shù)在防控牡蠣體內(nèi)致病微生物的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）：青島市團(tuán)島農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；RNA提取試劑盒：美國(guó)Omega Bio-tec公司；瓊脂糖：西班牙Biowest公司；FastPfu高保真DNA聚合酶：中國(guó)TransGen公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國(guó)Axygen公司；NEXTFLEX DNA測(cè)序建庫(kù)試劑盒：美國(guó)Bioo Scientific公司；MiSeq基因測(cè)序試劑盒：美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L1-600/10超高壓設(shè)備：天津華泰森淼生物科技有限公司；N13462C移液器、5424 R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；ELx800酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；QL-901渦旋混合器：海門其林貝爾儀器制造有限公司；GeneAmp9700型PCR儀：美國(guó)ABI公司；NextSeq 500測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光計(jì)：美國(guó)Promega公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 新鮮牡蠣的采集與處理

將牡蠣用自來(lái)水沖洗干凈，單個(gè)封裝放進(jìn)高溫蒸煮袋中。之后進(jìn)行超高壓處理，具體流程：100、200、400 MPa處理5 min，其中升壓速度為20 MPa/s，泄壓時(shí)間可忽略不計(jì)。樣品處理完之后迅速在冰上用無(wú)菌手術(shù)刀取出腸道內(nèi)容物，放入液氮固定10 min后置于-80℃冰箱中待用。

1.3.2 RNA的提取與質(zhì)量分析

根據(jù)RNA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA抽提；超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度和純度；之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA和cDNA的質(zhì)量，用338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACH VGGGTWTCTAAT）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。

1.3.3 高通量測(cè)序

本部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用微型熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建雙端測(cè)序的文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)步驟如下。

1）連接“Y”字形接頭。

2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段。

3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集。

4）加入氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

利用Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

本部分也由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。

1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20 bp，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列。

2）根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)overlap之間的最大錯(cuò)配率為0.2，長(zhǎng)度需大于10 bp。

3）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個(gè)樣本，barcode需精確匹配，引物允許2 bp的錯(cuò)配，去除存在模糊堿基的序列。使用的UPARSE軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮牡蠣腸道菌群多樣性分析

新鮮牡蠣腸道菌群的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 牡蠣腸道菌群中檢測(cè)到的主要屬Table 1 Major bacterial genus detected in the gut microbiota of fresh oyster

續(xù)表1 牡蠣腸道菌群中檢測(cè)到的主要屬Continue table 1 Major bacterial genus detected in the gut microbiota of fresh oyster

新鮮牡蠣腸道菌群主要包括擬桿菌門（Bacteroi-detes，21%）、Epsilonbacteraeota（1%）、厚壁菌門（4%）、梭桿菌門（Fusobacteria，6%）、變形菌門（43%）和柔膜菌門（22%）；在主要屬（至少一個(gè)樣品中占整個(gè)群落的1%）中，弧菌屬最多，其次是支原體屬（Mycoplasma）和Roseimarinus屬，其它的還有葡萄球菌屬、丙酸菌屬、氣單胞菌屬、Psychrilyobacter、油螺旋菌屬和黃單胞菌屬。

PIERCE等[3]分析了東部牡蠣的菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)在門水平上主要以變形菌門、柔膜菌門、厚壁菌門等為主；曹榮等[11]采用了高通量測(cè)序方法分析牡蠣的微生物群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在目的分類水平上，弧菌目（Vibrionales，49.3%）、交替單胞菌目（Alteromonadales，12.2%）占優(yōu)勢(shì)；在科的分類水平上，主要是弧菌科（Vibrionaceae，36.8%）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae，10.3%）和交替假單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae，7.2%）；在屬的分類水平上，弧菌屬（28.3%）、希瓦氏菌屬（10.3%）、交替假單胞菌屬（7.2%）比例相對(duì)較高。這些報(bào)道與本研究的結(jié)果相似。

2.2 超高壓處理對(duì)牡蠣腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

超高壓處理后，對(duì)牡蠣腸道菌群進(jìn)行了多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表征微生物總物種的數(shù)量，Shannon指數(shù)代表細(xì)菌群落的多樣性。

表2 超高壓處理后牡蠣腸道菌群多樣性的變化Table 2 Effect of UHP treatment on the diversity of oyster gut microbiota

由表 2 可知，與 0.1MPa（對(duì)照組）相比，100、200MPa和400 MPa組的Chao1和ACE指數(shù)有所提高，但是沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這表明超高壓處理可以使牡蠣腸道菌群的總量有所變化。經(jīng)過(guò)超高壓處理后，Shannon指數(shù)有所下降，這表明超高壓處理可以使牡蠣腸道菌群的多樣性降低。而且4個(gè)組的測(cè)序覆蓋率都大于0.99，表明檢測(cè)數(shù)據(jù)可信。

為了解不同壓強(qiáng)的超高壓處理后牡蠣腸道中的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，分析了牡蠣腸道菌群的Shannon稀釋曲線、Sobs稀釋曲線、聚類分析和主成分分析，結(jié)果如圖1所示。

從圖1a可以看出對(duì)照組（0.1 MPa）和200 MPa的距離較遠(yuǎn)。經(jīng)過(guò)超高壓處理后，如圖1d所示，腸道菌群的PC1和PC2都發(fā)生了很大的變化。此外，由聚類分析可知，與對(duì)照組相比較，經(jīng)過(guò)超高壓處理后牡蠣腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而且隨著壓強(qiáng)的升高，這種差異越來(lái)越大。

圖1 超高壓處理對(duì)牡蠣腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of UHP treatment on the structure of oyster gut microbiota

為更深入地了解超高壓處理后牡蠣腸道菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，在門水平進(jìn)行了分析，具體見(jiàn)圖2。

圖2 超高壓處理前后牡蠣腸道菌群在門水平上的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of oyster gut microbiota at the phylum level before/after UHP treatment

由圖2a可知，在門水平上，牡蠣腸道中主要的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、擬桿菌門、柔膜菌門、厚壁菌門、Epsilonbacteraeota和梭桿菌門6個(gè)門。由圖2b～圖2d可知，與對(duì)照組相比，超高壓處理對(duì)變形菌門、擬桿菌門和柔膜菌門的相對(duì)豐度產(chǎn)生了很大的影響。其中超高壓處理顯著增加了擬桿菌門的相對(duì)豐度，與對(duì)照組相比，400 MPa組中擬桿菌門的相對(duì)豐度升高了57.31%。100 MPa和200 MPa組擬桿菌門的相對(duì)豐度則分別升高了5.77%和0.69%。與對(duì)照組相比，超高壓處理顯著降低了柔膜菌門的相對(duì)豐度，經(jīng)過(guò)100、200 MPa和400 MPa處理后柔膜菌門的相對(duì)豐度分別降低21.94%、21.07%和22.16%。變形菌門的相對(duì)豐度在經(jīng)過(guò)100 MPa和200 MPa處理后有所升高，而當(dāng)壓強(qiáng)升高到400 MPa時(shí)，其相對(duì)豐度卻顯著下降了23.90%。

牡蠣腸道中變形菌門、擬桿菌門和柔膜菌門是三大優(yōu)勢(shì)菌[3，10]。變形菌門細(xì)菌都為革蘭氏陰性菌，且包括很多致病細(xì)菌，如大腸桿菌、沙門氏菌和霍亂弧菌等。超高壓處理是一種很有效的殺滅致病菌的加工方式[12]，CAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣經(jīng)過(guò)300 MPa處理2 min后變形菌門的相對(duì)豐度由77.5%下降到60.0%。由此表明超高壓處理后牡蠣腸道菌群趨向于健康的方向發(fā)展。

為更進(jìn)一步了解超高壓處理對(duì)牡蠣腸道優(yōu)勢(shì)菌群的影響，在科水平和屬水平上進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超高壓處理前后牡蠣腸道科水平和屬水平優(yōu)勢(shì)菌群Fig.3 Dominant gut microbiota of oyster at the family level and genus level before/after UHP treatment

由科水平上的相對(duì)豐度（圖3a）可知，超高壓處理后，各組腸道菌群在科水平上主要分為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、弧菌科、Nitrincolaceae、支原體科（Mycoplasmataceae）、Cryomorphaceae、 葡 萄 球 菌 科（Staphylococcaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、Prolixibacteraceae、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、氣單胞菌科（Aeromonadaceae）和梭桿菌科（Fusobacteriaceae）12個(gè)科。在對(duì)照組中，弧菌科、支原體科、Prolixibacteraceae和梭桿菌科的占比較大；100 MPa組和200 MPa的腸道菌群組成較為相似，其中黃桿菌科、Nitrincolaceae和葡萄球菌科的占比較大；而400 MPa組的腸道菌群變化最為明顯，其腸道菌群主要由黃桿菌科組成，占比超過(guò)70%。由圖3b可以看出，各組腸道菌群在屬水平上主要分為Pseudofulvibacter、弧菌屬、Amphritea、葡萄球菌屬、支原體屬、Roseimarinus、黃單胞菌屬、氣單胞菌屬、Pseudophaeobacter、Psychrilyobacter、Flaviramulus、黃桿菌屬（Flavobacterium）、 極 地 桿 菌 屬 （Polaribacter）和Tenacibaculum等14個(gè)屬。在對(duì)照組中，弧菌屬、支原體屬和Roseimarinus占比較大；100 MPa組中，Pseudophaeobacter占比最大；而200 MPa組和400 MPa的腸道菌群變化較大且這兩組的菌群組成也較為相似，主要以黃桿菌屬、氣單胞菌屬、葡萄球菌屬、黃單胞菌屬和Amphritea為主。CRUZ-ROMERO等[9]報(bào)道260 MPa超高壓處理的牡蠣中分離出的細(xì)菌是惡臭希瓦氏菌和熒光假單胞菌，而經(jīng)過(guò)500MPa處理后牡蠣中主要的微生物是芽孢桿菌屬（Bacillus）、微球菌屬（Micrococcus）、Alcaligenes、 葡 萄 球 菌 屬 、 莫 拉 氏 菌 屬（Moraxella）和不動(dòng)桿菌屬。

2.3 超高壓處理對(duì)牡蠣腸道的顯著菌群影響

為更清楚地了解超高壓處理后牡蠣腸道中具體哪些菌群發(fā)生了顯著的變化，本研究采用了LEfSe分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 LEfSe分析100、200、400 MPa和對(duì)照組之間在屬水平上的顯著差異菌群Fig.4 The significantly different flora between control group and 100 MPa，200 MPa，400 MPa at the genus level identified by LEfSe analysis

經(jīng)過(guò)100 MPa處理后，在屬水平上，弧菌屬、嗜冷菌屬（Psychrilyobacter）、支原體屬、梭桿菌屬（Fusobacterium）、OM43_clade和 Labilibacter的相對(duì)豐度顯著降低。而經(jīng)過(guò)100 MPa處理后，Kordiimonas、Aquimarina和極地桿菌屬（Polaribacter）的相對(duì)豐度顯著增加（圖4a）。經(jīng)過(guò)200 MPa處理后，支原體屬、OM43_clade和Labilibacter的相對(duì)豐度顯著降低，這與100 MPa處理后的變化一致。而海洋桿菌屬（Oceanobacillus）、Aquimarina、扭鏈瘤胃球菌屬（Ruminococcus__torques）、副球菌屬（Paracoccus）、Vogesella、Pajaroellobacter、微球菌屬、Clostridium_sensu_stricto、Neptuniibacter和食酸菌屬（Acidovorax）的相對(duì)豐度顯著增加（圖4b）。經(jīng)過(guò)400MPa處理后有54種顯著差異菌，其中21種菌屬的相對(duì)豐度顯著降低，33種菌屬的相對(duì)豐度顯著增加。在顯著降低的菌屬中，除了弧菌屬、支原體屬、Psychrilyobacter、OM43_clade 和 Labilibacter之外，還有葡萄球菌屬、氣單胞菌屬、黃單胞菌屬、腸球菌屬、火色桿菌屬（Flammeovirga）、氣球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬（Weissella）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、硫磺單胞菌屬（Sulfurospirillum）、Tepidimicrobium 和類香味菌屬（Myroides）等。而顯著增加的菌屬中，除了極地桿菌屬、Aquimarina、副球菌屬外，黃桿菌科的Pseudofulvibacter、Flaviramulus、黃桿菌屬、極地桿菌屬（Polaribacter）、Tenacibaculum、Flavicella、Olleya、Maribacter、Algibacter、Kriegella、Arenibacter、噬纖維菌屬（Cellulophaga）、Pricia和 Muricauda等菌屬的相對(duì)豐度顯著增加；紅桿菌科的Loktanella、Sulfitobacter、Aliiroseovarius、Lentibacter、Jannaschia、Pseudophaeobacter和Planktotalea的相對(duì)豐度也顯著增加（圖4c）。

弧菌屬是一種廣泛存在于水環(huán)境中的革蘭氏陰性細(xì)菌，在牡蠣養(yǎng)殖水體中較為常見(jiàn)，包含多種食源性致病微生物，霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌是其中最常見(jiàn)的致病微生物[13]；梭桿菌屬可能與炎癥性腸病相關(guān)，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病，其豐度的增加會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生[14-15]；葡萄球菌屬?gòu)V泛分布在各種環(huán)境中，包括人和動(dòng)物的皮膚和黏膜以及土壤、沙子和水，并可引起食源性疾病，如金黃色葡萄球菌（S.aureus）[16]；氣單胞菌屬?gòu)V泛存在于淡水、魚(yú)類和貝類中，是常見(jiàn)的食源性致病微生物，可引起自限性腹瀉，其中兒童是最易受感染的人群[17]；腸球菌屬是重要的人類病原體，如最常見(jiàn)的人類分離株糞腸球菌（E.faecalis）和屎腸球菌（E.faecium），可引起尿路、腹內(nèi)、骨盆和傷口感染[18]；類香味菌屬是常見(jiàn)于環(huán)境來(lái)源的細(xì)菌，例如水和土壤，同時(shí)也是一種病原微生物，傾向于侵染免疫功能低下的宿主[19]；氣球菌屬是成簇生長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，被認(rèn)為是一種人類病原體，可引起尿路感染和敗血癥[20]。經(jīng)過(guò)超高壓處理后，這些致病菌屬的相對(duì)豐度顯著降低，而且僅經(jīng)過(guò)100 MPa處理5 min后，弧菌屬和梭桿菌屬相對(duì)豐度就有大幅的降低，表明超高壓處理能有效減少牡蠣腸道中的有害微生物。

除此之外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)超高壓處理后的牡蠣未發(fā)現(xiàn)（或相對(duì)豐度<0.1%）牡蠣中常見(jiàn)的腐敗微生物，如交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬。交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬可使水產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中產(chǎn)生不良?xì)馕?，已被證實(shí)是多種水產(chǎn)魚(yú)類和貝類低溫貯藏過(guò)程中的特定腐敗菌[11，21]。因此，超高壓處理還能降低牡蠣在貯存過(guò)程中發(fā)生腐敗的風(fēng)險(xiǎn)，并且有助于改善牡蠣的貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期。

Kordiimonas包含棒狀、嚴(yán)格需氧的耐鹽細(xì)菌，存在于海洋沉積物中[22]。Aquimarina的細(xì)菌均從海水、沉積物、海膽和海洋海綿中分離出來(lái)，表明該屬的成員廣泛分布于海底環(huán)境中[23]。海洋桿菌屬、副球菌屬、Vogesella、Pajaroellobacter、Neptuniibacter 和微球菌屬大多分布于海洋環(huán)境中，具有較好的耐壓性[24-27]。黃桿菌科的微生物廣泛分布于海洋環(huán)境中，如嗜冷黃桿菌（F.psychrophilum）和柱狀黃桿菌（F.columnare），以及包含許多具有環(huán)境和生物技術(shù)意義的細(xì)菌[28]。同樣，紅桿菌科的微生物也大多分布于海洋中，而且紅桿菌科的微生物是地球生物化學(xué)循環(huán)的關(guān)鍵參與者，在遠(yuǎn)洋環(huán)境中占細(xì)菌群落的30%，并且通常與真核生物共生[29]。超高壓處理后，上述這些海洋源菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，表明了海洋源的微生物具有一定的耐高壓的能力。海洋微生物所處的環(huán)境中有高壓的存在，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中這些微生物已經(jīng)適應(yīng)了在一定壓強(qiáng)的環(huán)境下存活，所以短時(shí)間超高壓處理并不能很好地殺滅這部分微生物。

3 結(jié)論

超高壓技術(shù)目前作為非熱殺菌成為牡蠣高品質(zhì)加工的重要趨勢(shì)，但該技術(shù)對(duì)處理后牡蠣體內(nèi)菌群輪廓不清晰、保證牡蠣產(chǎn)品安全性的超高壓技術(shù)參數(shù)不全面。針對(duì)這些問(wèn)題，本文主要研究了100、200 MPa和400 MPa處理5 min對(duì)牡蠣腸道菌群多樣性的影響。首先分析了牡蠣腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化，然后分析了高靜水壓對(duì)牡蠣腸道菌群在門、科和屬水平上的變化，最后通過(guò)LEfSe分析顯著變化的腸道菌群。研究結(jié)果表明，超高壓處理可使牡蠣腸道菌群的總量有所變化，降低腸道菌群的多樣性。超高壓處理更有利于弧菌、氣單胞菌等致病菌相對(duì)豐度的減少，100 MPa、5min的處理即可達(dá)到顯著降低致病菌相對(duì)豐度的效果，從而有效降低牡蠣的食用風(fēng)險(xiǎn)。此外，超高壓處理后能有效殺滅水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗微生物，如交替假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，從而降低牡蠣在貯存過(guò)程中發(fā)生腐敗的風(fēng)險(xiǎn)，并且有助于改善牡蠣的貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期。海洋源的菌屬表現(xiàn)出很好的耐壓性，400 MPa、5 min處理的牡蠣腸道菌群主要由黃桿菌科組成，占比超過(guò)70%。