劉玉蓮，巫芳華，楊開令，周 穎，高宇容，劉 微

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

缺血性腦卒中作為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病之一，其特點(diǎn)是具有較高的致殘率和致死率，一般臨床上治療采取早期溶栓，但其治療效果仍不理想[1]。炎癥是腦缺血主要的發(fā)病機(jī)理之一，主要涉及外周炎癥細(xì)胞的浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生[2]。探索炎癥的機(jī)制，尋找有效的治療新靶點(diǎn)，對防治缺血性腦卒中具有重要意義。

炎性細(xì)胞，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞，是免疫防御系統(tǒng)抗腦缺血損傷的主要介質(zhì)。腦缺血后，迅速遷移到損傷部位的小膠質(zhì)細(xì)胞，會啟動效應(yīng)分子的釋放和其他免疫細(xì)胞的募集[3]。被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞主要分為M1和M2兩種表型并各自發(fā)揮不同的作用，M1型的小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放炎性因子，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重腦組織損傷[4]。而M2型的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor -β，TGF-β)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)以及精氨酸1(arginase-1，Arg-1)等，促進(jìn)腦組織的修復(fù)[5]。因此，將被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞從促炎性M1型向抗炎性M2型轉(zhuǎn)變是治療缺血性腦卒中的一個(gè)新思路。

消退素D1(resolvin D1，RvD1)屬于一類新的特異性促分解脂質(zhì)介質(zhì)，由二十二碳六烯酸衍生而來的代謝產(chǎn)物，并且能夠限制中性粒細(xì)胞的募集或浸潤，抑制炎性因子的產(chǎn)生[6]。甲酰肽受體2(formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2)也稱為甲酰肽樣受體1或脂氧素A4受體，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在抗炎中起重要作用，其廣泛分布于大腦中，特別是在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[7]。研究表明，在局灶性腦損傷后RvD1表達(dá)減少，其受體FPR2的表達(dá)增加，給予RvD1后減少小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減輕炎癥損傷，促進(jìn)功能恢復(fù)和神經(jīng)保護(hù)[8]。此外，在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)毒素性葡萄膜炎模型中，RvD1通過調(diào)節(jié)M1/M2極化減輕炎癥反應(yīng)[9]。然而，目前在腦缺血/再灌注模型中，RvD1調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化研究較少。因此，本研究探討RvD1通過FPR2調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化，從而減輕腦缺血/再灌注后炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD大鼠，♂，大鼠體質(zhì)量(250-300) g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動物中心購買，合格證號為SCXK(粵)2013-0034。定期給大鼠添加食物和水，保持動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度在20℃-25 ℃，定期給實(shí)驗(yàn)室消毒。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究原則。

1.2 試劑FPR2抗體(Novus，NLS1878)；抑制劑Boc-2(Absin，abs4512)；RvD1(Cayman，10012554)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，T8877)；MPO抗體(Abcam，ab9535)；Iba1兔抗(Wako，019-10741)；Iba-1鼠抗(Santa cruz，sc-32725)；CD206抗體(Santa cruz，sc-70585)；CD16抗體(BD，553141)；RNA快速提取試劑盒(蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司，B0004DP)；預(yù)混型反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒(廣州瑞真生物技術(shù)有限公司，AG11706、AG11701)。

1.3 儀器勻漿儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；低溫高速離心機(jī)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國ZESS公司)；熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)；

1.4 MCAO模型制備根據(jù)文獻(xiàn)[10]參照改良線栓法，術(shù)前禁食12 h左右，麻醉后采用仰臥位去固定大鼠，從頸部的正中線切口，將大鼠右側(cè)頸總動脈，頸外動脈和頸內(nèi)動脈鈍性分離。在近心處的頸外動脈剪V型切口，插入頸內(nèi)動脈的線栓約為18-20 mm，會感受到稍微的阻力感，說明線栓已插入到中動脈起始處，缺血2 h后，將插入的線栓拔出并用縫合線縫合傷口，24 h后進(jìn)行下一步操作。Sham組不進(jìn)行插入線栓的操作。待大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分?jǐn)?shù)在1-3分為造模成功，可納入實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 分組與用藥將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組、RvD1組和RvD1+Boc-2組，每組6只。在線栓阻塞大鼠大腦中動脈后立即腹腔注射RvD1(0.4 μg·kg-1)[8]；在造模前30 min通過腹腔注射給藥FPR2拮抗劑Boc-2(0.4 mg·kg-1)[11]。給予術(shù)后Sham組和MCAO同等體積生理鹽水。

1.6 大鼠腦梗死體積測定腦缺血后24 h，麻醉大鼠并斷其頸部取腦，將大腦表面的殘留血用PBS溶液洗凈，將大鼠大腦放入模具中，冠狀位切成厚度為2 mm腦片，共6片，迅速將腦片浸入濃度為2%的TTC溶液中，注意避光，將腦組織放在37 ℃孵育箱10 min，需要5 min翻面一次，白色區(qū)域代表梗死，紅色區(qū)域代表未梗死。并拍照保存，然后分析腦梗死體積使用Image-pro-plus 6.0軟件。

1.7 免疫熒光染色腦缺血后24 h，將麻醉的大鼠剪開腹部，暴露心臟，然后用0.9%NaCl溶液進(jìn)行灌注，最后再用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，取出腦組織進(jìn)行脫水，按照厚度為10 μm進(jìn)行切片。具體步驟：先將切片加入Tris緩沖液(TBS)室溫浸泡30 min，再分別加入TBS/Triton漂洗10 min×3次，山羊血清封閉2 h后，分別加入稀釋后的一抗(FPR2 1 ∶500，鼠抗Iba-1 1 ∶100)，(MPO 1 ∶200)，(CD16 1 ∶200，CD206 1 ∶100，兔抗Iba-1 1 ∶400)；4 ℃孵育過夜，然后將玻片浸泡在TBS溶液10 min，TBS/Triton漂洗10 min×3次，室溫避光孵育二抗2 h；用TBS洗10 min×3次，封片，拍片。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)按照RNA快速提取試劑盒提取腦組織的總RNA。采用預(yù)混型反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)預(yù)混型qPCR試劑盒的說明書進(jìn)行操作，加入相應(yīng)的試劑。PCR反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，求同一樣本3個(gè)復(fù)孔的Ct平均值，以GAPDH的Ct值作為內(nèi)參，并采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列見Tab 1。

Tab 1 Primers used for quantitative real time PCR

2 結(jié)果

2.1 腦缺血后24 h FPR2與Iba-1的共定位如Fig 1所示，結(jié)果表明：各組大鼠腦缺血后可見FPR2與不同程度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1共定位表達(dá)。與Sham組比較，MCAO組可見被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞上FPR2的熒光表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)；與MCAO組比，RvD1干預(yù)后進(jìn)一步增強(qiáng)被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞上FPR2的熒光表達(dá)(P<0.01)；但聯(lián)合使用Boc-2后被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞上FPR2的熒光表達(dá)被抑制(P<0.01)。

Fig 1 Localization of FPR2 and Iba-1 in brain at 24 h post

2.2 RvD1對腦缺血后24 h腦梗死體積變化的影響結(jié)果表明：與Sham組比，MCAO組的大鼠腦梗死區(qū)域增加明顯(P<0.05)；經(jīng)過RvD1干預(yù)后大鼠的腦梗死體積比MCAO組降低(P<0.05)；與RvD1組比，RvD1與Boc-2聯(lián)用使大鼠腦梗死體積有增加趨勢(P<0.05),見Fig 2。

Fig 2 Effect of RvD1 on volume change of cerebral infarction 24 h after

2.3 RvD1對腦缺血后24 h MPO表達(dá)的影響如Fig 3所示，與Sham組比，MCAO組的MPO表達(dá)增加(P<0.05)；與MCAO組比，給予RvD1后MPO表達(dá)下降(P<0.05)；而聯(lián)合使用Boc-2后逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 Effect of RvD1 on MPO expression after

2.4 RvD1對腦缺血后24 h小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)變的影響如Fig 4所示，與Sham組比，MCAO組CD16+/Iba-1+和CD206+/Iba-1+細(xì)胞的數(shù)量增加明顯(P<0.01)；與MCAO組比，RvD1組CD16+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而CD206+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)增加(P<0.01)；與RvD1組比，RvD1+Boc-2組CD16+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)有所增加，而CD206+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 RvD1對腦缺血后24 h小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響與Sham組比，MCAO組M1型TNF-α、iNOS、IL-1β和M2型TGF-β1、IL-10、Arg-1 mRNA的表達(dá)增加(P<0.05)；與MCAO組比，RvD1組M1型TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)下降明顯，而M2型TGF-β1、IL-10、Arg-1mRNA表達(dá)增加更為明顯(P<0.05)；與RvD1組相比，RvD1與Boc-2聯(lián)合使用后M1型TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)有所增加，而M2型TGF-β1、IL-10、Arg-1 mRNA的表達(dá)受到抑制(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 5 Effect of RvD1 on expression of M1/M2

3 討論

腦缺血的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中炎癥在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。FPR2在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)[7, 12]，RvD1是由ω-3脂肪酸衍生的內(nèi)源性脂質(zhì)分子，以高親和力激活FPR2并發(fā)出促分解反應(yīng)的信號[13]。RvD1與FPR2結(jié)合后可以減輕炎癥損傷，但關(guān)于RvD1是否可減輕腦缺血后的炎癥損傷，目前并沒有報(bào)道。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦缺血后腦組織損傷加重，MPO表達(dá)增多，表明大鼠腦缺血后出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。具有抗炎作用的FPR2蛋白表達(dá)增加有利于減輕炎癥反應(yīng)，提示FPR2在缺血性腦損傷中具有內(nèi)源性保護(hù)作用。另外，本研究發(fā)現(xiàn)外源性RvD1進(jìn)一步增加FPR2的表達(dá)，與之類似的是,有研究報(bào)道外源性抗炎脂質(zhì)介質(zhì)如脂氧素A4和RvD1可以增加FPR2表達(dá)，促使炎癥消退并恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[7, 14]，但具體機(jī)制還需日后進(jìn)一步探討。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后使用RvD1可減少腦梗死體積和MPO表達(dá)，同時(shí)免疫熒光雙染表明FPR2在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，這提示RvD1很可能通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞減輕炎癥損傷。

小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)下為分支狀，可有效監(jiān)測微環(huán)境并及時(shí)清除凋亡神經(jīng)元，讓大腦處于穩(wěn)定狀態(tài)[15]。腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，其特征是肥大的形態(tài)和增厚的突起，呈阿米巴樣，并遷移到損傷部位。其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量炎性介質(zhì)，加劇腦組織損傷，而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放具有修復(fù)性的抗炎因子，發(fā)揮腦保護(hù)作用[5]。肝缺血/再灌注模型中，RvD1已被證實(shí)通過FPR2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[16]，提示RvD1很可能對缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞的極性轉(zhuǎn)換發(fā)揮作用。在早期腦損傷模型中，Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，M1型炎癥因子表達(dá)增多，而給予RvD1后M2型抗炎因子增多，炎癥因子表達(dá)受到抑制[6]。另外，RvD1可促進(jìn)BV2細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[17]。本研究將Iba-1分別與M1型標(biāo)志物CD16、M2型標(biāo)志物CD206進(jìn)行免疫熒光雙染，發(fā)現(xiàn)腦缺血后CD16+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)比CD206+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)增加更為顯著，提示腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞激活向M1型轉(zhuǎn)化。而RvD1治療后CD16+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)減少和CD206+/Iba-1+細(xì)胞數(shù)的增加，表明RvD1可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型方向極化。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步顯示，RvD1干預(yù)后抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥介質(zhì)TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)，促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎介質(zhì)Arg-1、IL-10、TGF-β1 mRNA的表達(dá)。并且有研究表明，外源性RvD1減少小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，增加抗炎因子表達(dá)，且基因水平和蛋白水平表達(dá)一致[6]。上述結(jié)果提示RvD1干預(yù)后促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1表型向M2表型極化，從而減輕炎癥損傷。

此外，在肝缺血模型中使用拮抗劑Boc-2會降低FPR2表達(dá)，進(jìn)而抑制RvD1對小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化的作用[16]。為了進(jìn)一步探討FPR2在RvD1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化中的作用，本研究采用FPR2拮抗劑Boc-2與RvD1聯(lián)合給藥進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)M1型標(biāo)記物和炎性介質(zhì)表達(dá)有增加的趨勢，而M2型標(biāo)記物和抗炎因子的表達(dá)都受到抑制，這說明Boc-2阻斷FPR2的作用，使RvD1對大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用受到抑制。這些結(jié)果表明RvD1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化是通過激活FPR2實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，RvD1通過激活FPR2促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，減輕大鼠腦缺血/再灌注后的炎癥損傷，從而發(fā)揮腦的保護(hù)作用。

( 本實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心完成，感謝所有老師及同學(xué)們的支持與幫助! )