宋偉華，謝欣辛，秦 瓊，范國(guó)榮

(1. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080;2. 上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海 200443;3. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州 215006)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以氣道高反應(yīng)性為特征的由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘具有明顯的異質(zhì)性，根據(jù)患者肺部及氣道組織中不同類型的炎癥細(xì)胞，哮喘可分為嗜酸粒細(xì)胞型(eosinophilic asthma，EA)、中性粒細(xì)胞型(neutrophilic asthma，NA)和混合粒細(xì)胞型(mixed granulocytic asthma，MA)[1]。有研究顯示[2]，NA對(duì)激素的治療反應(yīng)性差，臨床癥狀比其它類型的哮喘更難控制，但其具體機(jī)制尚未完全明確。因此，深入探討NA的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)及干預(yù)藥物具有重要的臨床意義。

隨著基因芯片技術(shù)與高通量技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘可以快速有效地篩選出差異基因，近年來(lái)，廣泛應(yīng)用于疾病的致病機(jī)制的闡明、藥物治療靶點(diǎn)的篩選[3-5]。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出NA的相關(guān)差異基因，進(jìn)而對(duì)這些基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集分析，并從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出關(guān)鍵基因，采用分子對(duì)接技術(shù)篩選潛在的先導(dǎo)化合物，為進(jìn)一步闡明NA的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 差異基因的篩選基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE137268芯片，利用GEO2R在線分析工具對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出滿足|log(2 Fold Change)|≥1.0且P<0.05的差異表達(dá)基因，同時(shí)至少一個(gè)樣品該基因FPKM≥1(去除表達(dá)量低的基因)。其中l(wèi)og 2FC正值為上調(diào)基因，log 2FC負(fù)值為下調(diào)基因。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選將獲得的差異基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)定為人類，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，下載TSV文件，利用 Cytoscape 軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，對(duì)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，將節(jié)點(diǎn)中心度值(Degree)排在前10位的基因靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 差異基因的GO功能與KEGG信號(hào)通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行GO(Gene ontology，GO)基因功能注釋分析，包括生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細(xì)胞組分(Cellular component， CC); 并對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析。選取前10個(gè)條目進(jìn)行分析，以P<0.05作為顯著性基因富集篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 分子對(duì)接技術(shù)篩選先導(dǎo)化合物采用ChemSketch軟件畫(huà)出對(duì)接化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其3D結(jié)構(gòu)能量最小化后保存為MOL格式。將目標(biāo)基因上傳至PDB數(shù)據(jù)庫(kù)，將基因的3D結(jié)構(gòu)保存為PDB格式，用iGEMDOCK分子對(duì)接軟件進(jìn)行對(duì)接，根據(jù)對(duì)接能量的高低來(lái)判斷靶蛋白與化合物的結(jié)合程度，能量越低，代表二者的結(jié)合程度越高。

2 結(jié)果

2.1 NA與健康人群中差異表達(dá)基因的篩選從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE137268芯片獲得了11個(gè)NA和15個(gè)健康人的誘導(dǎo)痰基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過(guò)GEO2R對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出滿足|log2FC|≥1.0且P<0.05的差異表達(dá)基因，共篩選出147個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因7個(gè)，下調(diào)基因140個(gè)，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 The differential expression genes of NA patients compared with healthy people

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape軟件將綜合得分大于0.4的相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。如Fig 1所示，該網(wǎng)絡(luò)由99節(jié)點(diǎn)和326邊構(gòu)成，節(jié)點(diǎn)代表基因靶點(diǎn)，邊代表相互作用。使用Cytoscape 軟件中的“NetworkAnalyzer”插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)Degree值排序，排名前10的關(guān)鍵基因分別為CXCL8、FPR2、CXCL1、TNFRSF1B、CXCR1、FPR1、CXCR4、CLEC4D、GPR84與CXCR2。

Fig 1 PPI network of differential expression genes

2.3 GO注釋與KEEG通路富集分析通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)147個(gè)差異基因進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析，結(jié)果見(jiàn)Fig 2與Tab 2。GO富集顯示這些基因主要參與炎癥反應(yīng)、趨化作用、免疫反應(yīng)等生物過(guò)程；在細(xì)胞組分中主要影響細(xì)胞膜、細(xì)胞外泌體、膜錨蛋白等；在分子功能中主要影響受體活性、碳水化合物結(jié)合與IL-8受體活性等。KEGG通路富集分析顯示，差異表達(dá)基因與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路、NOD樣受體、補(bǔ)體與凝血等信號(hào)通路有關(guān)。

Tab 2 KEGG enrichment analysis of differential expression genes

Fig 2 GO enrichment analysis of differential expression genes

2.4 分子對(duì)接結(jié)果將SERPINA1、PLAU、C8B、CD55與CXCL8基因與具有抗補(bǔ)體活性的化合物芍藥苷元酮、白藜蘆醇、雷公藤甲素進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果如Tab 3所示，結(jié)果表明芍藥苷元酮與C8B、PLAU、CXCL8結(jié)合能力較強(qiáng)，各化合物與補(bǔ)體與凝血通路中的PLAU、C8B靶蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)，其中芍藥苷元酮與雷公藤甲素與C8B的結(jié)合能力最強(qiáng)，其分子對(duì)接示意圖如Fig 3、4所示。

Fig 3 Molecular docking diagram of paeoniflorigenone with C8B

Fig 4 Molecular docking diagram of triptolide with C8B

Tab 3 Results of molecular docking

3 討論

NA以肺組織中性粒細(xì)胞增多為特點(diǎn)，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀，對(duì)糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)較差，其具體機(jī)制尚未完全明確。為了進(jìn)一步闡明NA的發(fā)病機(jī)制，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE137268芯片中NA患者與健康人群中的誘導(dǎo)痰的表達(dá)基因分析，獲得了147個(gè)差異基因，其中7個(gè)為上調(diào)基因，140個(gè)為下調(diào)基因。對(duì)這些差異基因進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析、GO功能注釋與KEGG通路富集分析。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到了10個(gè)核心基因，根據(jù)它們的Degree值確定CXCL8基因最為關(guān)鍵。CXCL8作為重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，趨化與活化中性粒細(xì)胞匯集于肺組織，引起肺部炎癥和氣道高反應(yīng)。近年的研究表明[6]，患者肺泡灌洗液中CXCL8的濃度與中性粒細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，與FVC/FEV1成明顯的負(fù)關(guān)系。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法進(jìn)一步證明了CXCL8在NA的致病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

KEGG富集分析顯示，差異基因受多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)通路，這些通路在以往的研究中被證實(shí)參與了哮喘的炎癥過(guò)程[7-9]。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體與凝血信號(hào)通路參與了NA的病理過(guò)程。補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體重要的免疫系統(tǒng)，在免疫防御中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)經(jīng)典、旁路和凝集素途徑激活后，其活化產(chǎn)物C3a與C5a是重要的趨化因子，募集與活化嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞匯集于肺組織[10]，釋放多種炎癥介質(zhì)如CXCL8、IL-6、IL-1與TNF-α，從而此起氣道高反應(yīng)[11-12]。此外，補(bǔ)體激活產(chǎn)物C5a能直接抑制中性粒細(xì)胞凋亡，加重氣道炎癥反應(yīng)[13]。這提示補(bǔ)體系統(tǒng)的激活在NA的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用。采用抗補(bǔ)體藥物抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活或許可以達(dá)到治療NA的目的。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗補(bǔ)體藥物治療NA的可行性，我們選取了文獻(xiàn)報(bào)道具有較強(qiáng)補(bǔ)體抑制活性的芍藥苷元酮、白藜蘆醇與雷公藤甲素3個(gè)化合物與補(bǔ)體與凝血通路中的4個(gè)基因SERPINA1、PLAU、C8B與CD55以及受多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)的CXCL8基因進(jìn)行分子對(duì)接[14-16]。分子對(duì)接顯示各化合物與上述靶蛋白均具有較好的結(jié)合活性，尤以芍藥苷元酮與雷公藤甲素與C8B的結(jié)合能力最強(qiáng)。C8B是組成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)的重要成分之一。補(bǔ)體系統(tǒng)異?；罨a(chǎn)生的MAC可激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞釋放IL-8、IL-1等細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)[17]。

雷公藤甲素是傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性。黎雄斌等研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以明顯緩解中性粒細(xì)胞哮喘小鼠氣道炎癥，但其機(jī)制不明確[18]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法和分子對(duì)接技術(shù)揭示了雷公藤甲素治療NA的機(jī)制可能與其抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)度激活有關(guān)。課題組前期在中藥牡丹皮的抗補(bǔ)體活性成分的篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)芍藥苷元酮具有很好的抗補(bǔ)體活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷元酮與多個(gè)NA相關(guān)的靶蛋白具有很好的結(jié)合活性，其體內(nèi)藥理作用有待后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了NA的差異表達(dá)基因，篩選出的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路與NA的致病機(jī)制密切相關(guān)，進(jìn)一步通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)芍藥苷元酮與雷公藤甲素與補(bǔ)體與凝血通路的基因蛋白具有良好的結(jié)合活性，可以作為NA的潛在治療藥物。本研究為NA的治療提供了新的思路與方法。