程 浩，李 軒，方 樂，郝吉慶

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,安徽 合肥 230022)

世界癌癥數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果顯示，2018年全球新增1 810萬惡性腫瘤病例，其中肺癌的占比達到了11.6%，死亡率占比高達18.4%，均處于第一位,中國更是全球肺癌第一大國，其發(fā)病與死亡人數(shù)約占全球總?cè)藬?shù)近40%[1]。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的85%，但5年生存率僅約為15%[2]。多西他賽(Docetaxel)作為NSCLC患者標準二線化療藥物，長期使用容易產(chǎn)生耐藥性[3]。纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen like protein 1， FGL1)是一種重要的促進細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)因子，可通過旁分泌形式抑制腫瘤細胞增殖，在促進細胞有絲分裂、腫瘤血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤免疫逃逸等方面起關(guān)鍵作用[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1在肺腺癌細胞內(nèi)表達上調(diào)，且抑制FGL1表達能明顯提高多西他賽對肺腺癌細胞抑制率[6]，但對FGL1是否參與多西他賽誘導(dǎo)的其他生物學(xué)行為尚不清楚。本實驗旨在探討FGL1對多西他賽誘導(dǎo)的肺腺癌細胞侵襲、遷移能力的影響及其機制，為臨床治療尋找新的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 由中國科學(xué)院上海細胞庫提供本次實驗所需的人肺腺癌細胞株P(guān)C-9以及A549。

1.1.2藥物與試劑 多西他賽購自北京索萊寶有限公司(貨號ID0400),RPMI培養(yǎng)基購自Hylcone(貨號SH3002202),胰蛋白酶購自Sigma(貨號T4799)，胎牛血清購自賽默飛世爾科技-Gibco(貨號10270106 ),二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA) 試劑盒購自Beyotime(貨號P0010S),多聚甲醛購自Aladdin公司(貨號C104188)，Transwell小室購自Corning公司(貨號3422)，PVDF膜購自Millipore公司(貨號IPVH00010)，RT-qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司(貨號RR820A),E-cadherin抗體購自Abcam公司(貨號ab184633)，N-cadherin抗體購自Abcam公司(貨號ab173341)，F(xiàn)GL1抗體購自Abcam公司(貨號ab197357)，β-actin抗體購自Proteintech公司(貨號60008-1-lg),FGL1-siRNA重組序列、隨機陰性對照序列由上海吉凱基因公司提供，見Tab 1。

Tab 1 The primer sequence of FGL1 and GAPDH

1.1.3儀器 細胞培養(yǎng)超凈工作臺(上海智誠)，制冰機(常熟凌科)，高壓滅菌鍋(廈門致微)，倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司)，CO2培養(yǎng)箱(上海力申)，實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，純水器( 美國Millipore 公司)，普通離心機( 德國Heraeus公司)。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)獲取與整理 檢索癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov 和Gene Expression Omnibus,GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)下載并整理FGL1基因相關(guān)測序信息和臨床數(shù)據(jù)，從TCGA數(shù)據(jù)庫下載包括515例肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)患者的腫瘤組織和59例正常組織測序信息，503例肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)和52例正常組織測序信息，同時針對FGL1在24種癌癥中差異表達進行分析處理。此外，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載具有完整臨床信息的204例肺腺癌患者總生存時間和預(yù)后結(jié)果，并根據(jù)FGL1表達水平將患者分為FGL1高表達組和FGL1低表達組。

1.2.2細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)基采用RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包含1%青-鏈霉素、10%胎牛血清，培養(yǎng)溫度37 ℃，并給予5% CO2。

1.2.3免疫印跡法檢測FGL1蛋白表達 Western blot法步驟如下：向肺腺癌細胞PC-9和A549細胞中加入蛋白裂解液放入4 ℃層析柜中的搖床上，4 ℃離心機離心30 min后取上清，然后將蛋白液與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃加熱10 min，每泳道加入適量樣品進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后,4 ℃孵育一抗過夜，β-actin與一抗FGL1稀釋1 000倍。一抗孵育之后每10 min用TBST溶液進行一次洗膜，30 min后添加二抗(羊抗鼠或者羊抗兔)，在常溫下孵育90 min，然后用TBST溶液進行漂洗，化學(xué)發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進行拍照分析，每次實驗需3次重復(fù)。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)檢測FGL1基因的表達 將處于對數(shù)期生長的人肺腺癌PC-9和A549細胞消化后接種至6孔板中，使細胞密度能夠達到80%-90%。收集細胞利用TRIzol試劑、氯仿、異丙醇試劑提取RNA，然后根據(jù)試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板用LightCycler480 System RT-PCR儀器進行擴增，每個PCR 循環(huán)的條件為95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 40 min，進行40次循環(huán)后停止，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。選用由公式Folds=2-△△CT計算FGL1基因相對表達量。

1.2.5細胞轉(zhuǎn)染 取肺腺癌PC-9和A549對數(shù)期生長期細胞，稀釋成1.0×108個·L-1的細胞密度接種至6孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染細胞的密度為40%-60%，siRNA轉(zhuǎn)染應(yīng)符合lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染程序，轉(zhuǎn)染48 h后添加蛋白裂解液提取蛋白或加TRIzol提取RNA，并通過Western blot法和RT-qPCR法驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.6Transwell遷移實驗 給予PC-9和A549各30 μmol·L-1多西他賽，藥物作用24 h后將各組細胞用0.2%胰酶消化制備成細胞懸液，PC-9和A549細胞數(shù)均為4×103個/孔。將600 μL的含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基加入各孔內(nèi)，將小室放入24孔板中，然后將PC-9和A549細胞懸液添加入上室繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后將上室拿出，將上室膜上細胞輕輕除去，在常溫下用4%多聚甲醛進行固定，時間25 min，然后用0.4%結(jié)晶紫染液進行染色，5 min后洗去浮色。在顯微鏡下進行細胞計數(shù)，每孔任意選擇6個視野進行計數(shù)，每組3個復(fù)孔，取平均值。

1.2.7細胞劃痕實驗 將細胞鋪在6孔板上，在血清饑餓24 h之前讓細胞生長至匯合細胞單層。接著用10 μL的無菌移液器或者針尖進行劃痕，去除培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，以消除漂浮細胞。觀察傷口寬度的變化規(guī)律，24 h后測量劃痕區(qū)的寬度，遷移率/%=(初始劃痕寬度-24 h后劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.2.8Transwell侵襲實驗 先構(gòu)建侵襲實驗小室模型，將事先準備Matrigel膠4 ℃過夜溶解，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋后取100 μL加入到小室膜上。實驗分組與遷移實驗相同分為6組，分別給予PC-9和A549各30 μmol·L-1多西他賽，藥物作用24 h后將各組細胞用0.20%胰酶消化制備成細胞懸液，PC-9和A549細胞數(shù)都采用 2×104個/孔。在24孔板中加入800 μL培養(yǎng)基(10% FBS)，在24孔板內(nèi)放入Transwell小室，在上室加入細胞懸液200 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d。將上室膜上細胞輕輕除去，在常溫下用4%多聚甲醛進行固定，時間25 min，然后用0.4%結(jié)晶紫染液進行染色，蒸餾水沖洗。最后在顯微鏡下對穿過基膜的細胞計數(shù)，每張膜選取6個視野計數(shù)，每組3個復(fù)孔，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 FGL1在非小細胞肺腺癌中表達情況為了鑒定FGL1在腫瘤和正常組織之間是否存在差異表達，利用R語言(R3.6.3,https://www.r-project.org)中的edgeR包對TCGA數(shù)據(jù)庫FGL1在各腫瘤組織中的差異表達進行分析,如Fig 1所示，通過泛癌分析證實FGL1在肺腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、食管癌和前列腺癌組織中表達上調(diào)，在肺腺癌和前列腺癌中FGL1升高的尤為顯著，提示FGL1可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展起著不可或缺的作用。

Fig 1 Differential expression of FGL1 in normal tissues and tumor

2.2 FGL1基因在肺腺癌中的表達與預(yù)后關(guān)系在GEO數(shù)據(jù)庫GSE31210數(shù)據(jù)集中下載FGL1的臨床樣本數(shù)據(jù)，搜集FGL1高表達和FGL1低表達肺腺癌患者各102例。由Fig 2可見，利用Kaplan Meier Plotter在線分析工具對患者的生存時間數(shù)據(jù)進行處理，提示在肺腺癌患者中FGL1高表達組預(yù)后較差(P<0.05)。

Fig 2 Analysis of survival curves of different expression levels of FGL1 gene in patients with lung adenocarcinoma

2.3 在肺腺癌細胞中敲降FGL1表達以FGL1基因為靶點的siRNA和非沉默 的對照siRNA分別干擾肺腺癌PC-9和A549細胞。如Fig 3所示，與對照組相比，PC-9和A549細胞中siFGL1組的FGL1蛋白表達量分別降低為(0.28±0.029)和(0.24±0.012),差異具有顯著性(P<0.01)。運用RT-qPCR技術(shù)檢測FGL1 mRNA水平，PC-9細胞siFGL1組FGL1mRNA表達水平下降至Con組的(0.30±0.08)，A549組中siFGL1組FGL1mRNA表達量下降至Con組的(0.39±0.037)，差異均具有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Effect of silencing FGL1 in lung adenocarcinoma PC-9 and A549 cells on FGL1

2.4 FGL1對多西他賽誘導(dǎo)的肺腺癌細胞侵襲能力的影響予以多西他賽藥物作用24 h后，采用Transwell侵襲實驗檢測FGL1對肺腺癌PC-9和A549細胞侵襲能力的影響。如Fig 4所示，與對照組相比，PC-9和A549細胞的siFGL1組和D組細胞侵襲能力均下降，且兩者聯(lián)合的siFGL+D組對細胞侵襲能力的抑制作用更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且兩種細胞的Con組和NC組比較、NC+D組與D組比較均有P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示敲減FGL1表達后可明顯降低的侵襲能力，聯(lián)合多西他賽后PC-9、A549 兩種肺腺癌細胞的侵襲能力下降更為明顯。

Fig 4 Effect of silencing FGL1 on invasion ability of lung adenocarcinoma PC-9 and A549

2.5 FGL1對多西他賽誘導(dǎo)的肺腺癌細胞遷移能力的影響予以多西他賽處理肺腺癌細胞24 h，首先通過沒有Marteigel的Transwell小室檢測FGL1對細胞遷移的影響。如Fig 5A，B所示，可見PC-9和A549細胞的siFGL1組和D組發(fā)生遷移的細胞數(shù)量均減少，且兩者聯(lián)合的siFGl1+D組發(fā)生遷移的肺腺癌細胞數(shù)目減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而兩種細胞的Con組與NC組比較、D組與NC+D組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。為了進一步驗證觀察結(jié)果，采用細胞劃痕實驗，通過鏡下觀察傷口的愈合情況來判定FGL1對細胞遷移的的影響。如Fig 5C,D所示，與對照組相比siFGL1組、D組劃痕間隙明顯增寬,且siFGL1+D組細胞遷移至劃痕口的細胞數(shù)量最少，劃痕裂隙最寬，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。從細胞形態(tài)學(xué)來看，與Con組、D組細胞相比較，siFGL1組和siFGL1+D組細胞明顯變圓，細胞更加聚集，遷移能力也明顯下降。這些特征可能和細胞上皮表型化密切相關(guān)。

Fig 5 The migration ability of lung adenocarcinoma PC-9 and A549 cells inhibited by silencing

2.6 FGL1對多西他賽誘導(dǎo)的肺腺癌細胞E-cadherin與N-cadherin表達水平的影響通過Western blot對EMT相關(guān)蛋白的表達進行檢測，結(jié)果顯示，與Con組與NC組相比，PC-9細胞(Fig 6A,C)與A549細胞(Fig 6B,D)的siFGL1組E-cadherin蛋白表達強度增高而促進細胞遷移蛋白N-cadherin表達強度減弱，差異均有顯著性(P<0.01)；且siFGL1+D組E-cadherin蛋白表達增高和N-cadherin表達下調(diào)的更為顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；另外，D組EMT相關(guān)蛋白表達無明顯變化，提示多西他賽對PC-9和A549細胞的EMT進程無明顯影響。而抑制FGL1可能會通過遏制EMT進程從而降低肺腺癌細胞的侵襲遷移能力，且聯(lián)合多西他賽后對肺腺癌細胞侵襲遷移能力抑制更顯著。

Fig 6 Effect of interference with FGL1 expression on expression of E-cadherin and N-cadherin in lung adenocarcinoma

3 討論

惡性腫瘤的主要特征之一就是腫瘤細胞會在不同器官間進行轉(zhuǎn)移，腫瘤致死的病例中大多與原發(fā)腫瘤的擴散與轉(zhuǎn)移有關(guān)，故探索腫瘤轉(zhuǎn)移的實質(zhì)有著重要意義[7]。近年來有研究報道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)可改善腫瘤細胞微環(huán)境和特異性增強其侵襲、轉(zhuǎn)移能力，并且EMT與化療耐藥存在共同信號傳導(dǎo)途徑[8]。EMT相關(guān)分子標志物有上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1)、波形蛋白(vimentin)和神經(jīng)性鈣黏蛋白(N-cadherin)等。由于EMT的激活，上皮鈣黏蛋白的表達受到抑制，導(dǎo)致典型的上皮細胞多邊形、鵝卵石形態(tài)缺失，細胞獲得紡錘形的間充質(zhì)細胞形態(tài)，且 N-cadherin,vimentin等蛋白表達增強[9]。非小細胞肺癌的二線標準化療方案主要是多西他賽，該藥物對微管的聚合有促進作用，并對解聚產(chǎn)生抑制，使細胞停留在G2/M期，阻止腫瘤細胞有絲分裂。但多西他賽長期使用后易產(chǎn)生獲得性化療耐受，從而對化療療效產(chǎn)生極大影響。研究發(fā)現(xiàn)影響多西他賽療效作用的機制之一為腫瘤細胞發(fā)生EMT樣形態(tài)學(xué)改變，降低肺癌細胞E-cadherin的表達增強NSCLC細胞侵襲遷移能力及藥物耐受性[10]。而細胞發(fā)生EMT也需要內(nèi)源或外源性的誘因，外源性誘因如缺氧，DNA甲基化等，內(nèi)源性誘因包括某些基因的突變或低表達等[11]。

作為纖維蛋白原家族成員，F(xiàn)GL1參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程，對腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)有一定影響，并對腫瘤血管生成和細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，NSCLC組織中FGL1的表達顯著上調(diào)，并與NSCLC患者的生存期和不良預(yù)后密切相關(guān)[5]，本研究通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中FGL1相關(guān)信息整理分析也再次驗證了這一結(jié)論。FGL1又稱肝細胞衍生纖維蛋白原相關(guān)蛋白1(hepatocyte-derived fibrinogen-related protein 1，HFREP-1)，是由腫瘤細胞或肝細胞合成并分泌，屬于纖維蛋白原家族。它位于人染色體8p21.3-p22,基因全長34 007 bp,由8個外顯子組成。原本是肝臟分泌的一種促進肝細胞有絲分裂的特異生長因子，通過自分泌形式刺激原代肝細胞增殖[12-13]。但它與纖維蛋白原家族其他成員不同是FGL1可與細胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后激活其下游通路，下游通路目前為止發(fā)現(xiàn)的主要為ERK1/2信號通路[4]，至于其對腫瘤細胞發(fā)揮效應(yīng)的確切機制目前尚無結(jié)論。Wang等[5]研究首次發(fā)現(xiàn)FGL1是LAG-3(lymphocyte activation gene 3)分子的主要功能“配體”，LAG-3蛋白存在于免疫系統(tǒng)T細胞表面上，二者相結(jié)合形成了一條新的免疫逃逸通路，腫瘤細胞利用此通路來保護自己免受T細胞攻擊，因此靶向FGL1將有助于激活T細胞的抗腫瘤能力。此外有研究發(fā)現(xiàn)FGL1在肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)突變型的肺癌細胞中表達也明顯上調(diào)，且通過實驗證實了FGL1通過抑制LKB1突變型肺腺癌細胞上皮質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而抑制肺癌細胞增殖[14]。Zhang等[15]研究也表明，相較于正常組織，F(xiàn)GL1在胃癌組織中表達明顯升高。通過體外實驗首次證實了FGL1可通過調(diào)控胃癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，且高表達FGL1可作為預(yù)測胃癌患者的不良預(yù)后的獨立指標。因此，我們推測FGL1突變可能是細胞發(fā)生EMT樣改變的一種誘因，并可能通過影響細胞EMT樣變化，從而對多西他賽誘導(dǎo)的肺腺癌細胞侵襲和遷移能力有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)在多西他賽相同劑量作用下，下調(diào)FGL1表達后的顯著降低了肺癌PC-9和A549細胞侵襲和遷移能力，并且降低間質(zhì)標志物N-cadherin蛋白表達，而增強上皮標志物E-cadherin蛋白表達，且均具有顯著性差異，提示敲降FGL1逆轉(zhuǎn)了多西他賽誘導(dǎo)的肺腺癌細胞EMT進程。

綜上所述，F(xiàn)GL1表達受到阻遏后可明顯增強多西他賽對肺腺癌PC-9和A549細胞的侵襲和遷移抑制能力，這可能與敲減FGL1表達后明顯抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。本實驗不足之處在于尚未建立體內(nèi)模型驗證，對于FGL1如何調(diào)控肺腺癌EMT樣改變，進而抑制肺癌細胞的侵襲遷移的具體機制有待后續(xù)進一步研究探索。