馬小斐， 劉函曄，王丹丹，宋藝蘭，延光海，李良昌

(吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

哮喘(asthma)是一種慢性炎癥性疾病。Th2類細(xì)胞因子如白介素(interleukin，IL)4、5和13等促進(jìn)IgE生成和炎癥細(xì)胞浸潤導(dǎo)致過敏性哮喘的發(fā)生。哮喘的治療通常使用皮質(zhì)類固醇藥物，長期激素類藥物的應(yīng)用會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，因此需要尋找更安全有效的哮喘治療藥物。

紫云英苷(astragalin，AG)是百蕊草、黃芪等多種傳統(tǒng)藥用植物的生物活性成分，近年來研究表明其具有明顯的抗炎作用。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷模型小鼠中發(fā)現(xiàn)紫云英苷能明顯降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平[1]，減輕氧化應(yīng)激并抑制卡拉膠誘導(dǎo)的足腫脹模型小鼠炎癥反應(yīng)[2]，抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)激活和炎癥介質(zhì)釋放[3]，也有研究報(bào)道紫云英苷通過降低細(xì)胞因子信號抑制物-3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)抑制Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)的哮喘氣道炎癥[4]。雖然紫云英苷抗哮喘等炎癥的作用已經(jīng)被證實(shí)，但從氧化應(yīng)激方面探討其抗哮喘作用的研究卻沒有被深入闡述。本論文旨在確定紫云英苷通過NOX2/ROS/NF-κB抑制哮喘氧化應(yīng)激和氣道炎癥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔級BALB/c小鼠50只，♂，6-8周齡，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號為：SCXK(吉)2017-0003。正常飲食，室溫下飼養(yǎng)。一切動物實(shí)驗(yàn)均通過延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理審查，遵循相關(guān)動物保護(hù)法。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 紫云英苷(MCE公司，貨號：HY-N0015)，OVA(美國Sigma，貨號：A3782)，氫氧化鋁凝膠(美國Sigma，貨號：1017502)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測DCFH-DA探針(碧云天公司，貨號：S0033S)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成公司，貨號：A001-3-2)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成公司，貨號：A003-1-2)；IL-4(貨號: BMS613)、IL-5(貨號：BMS610)、IL-13(貨號：BMS6015)的ELISA試劑盒(Invitrogen，美國)；IL-4(sc-53084)、IL-5(sc-398334)、p47phox(sc-17845)、p-IκBα(sc-8404)、p-NF-κB p65(sc-166748)抗體(Sant Cruz，美國)；NADPH氧化酶2(NOX2)(ab129068)、IL-13(ab108501)、IκBα(ab32518)、NF-κB p65(ab16502)和β-actin(ab8226)抗體(abcam，英國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠哮喘模型制備 小鼠分5組：正常(Normal)，哮喘(Model)，紫云英苷低(AG 25)，中(AG 50)和高(AG 100)劑量組，每組10只。每組小鼠在d1和d14腹腔注射OVA(10 μg)和氫氧化鋁(1 mg)懸濁液200 μL致敏，在d21-23，模型小鼠用OVA(0.1 g)生理鹽水混合液10 mL霧化吸入，吸入時間持續(xù)30 min，正常小鼠用生理鹽水代替。紫云英苷組在激發(fā)前1h分別按25，50和100 mg·kg-1灌胃治療。

1.2.2收集實(shí)驗(yàn) 最后一次激發(fā)24 h后處死小鼠，暴露氣管，將1 mL生理鹽水注入氣管后回抽獲取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)，離心取上清用于ELISA檢測，沉淀再懸浮，取200 μL甩片后Diff-Quik染色。小鼠左肺上葉固定后石蠟包埋。其余肺葉提取蛋白。

1.2.3BALF中細(xì)胞因子測定 ELISA法檢測BALF中IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子的水平。實(shí)驗(yàn)操作參照說明書。

1.2.4小鼠肺切片HE染色 石蠟包埋的肺組織5 μm連續(xù)切片，脫蠟后HE染色，觀察小鼠肺部炎癥變化。

1.2.5ROS、MDA 和SOD含量檢測 500 mg右肺組織勻漿后制備細(xì)胞懸液，按照說明書裝載DCFH-DA探針，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測ROS水平。實(shí)驗(yàn)操作參照說明書。 比色法檢測MDA和SOD水平。

1.2.6Western blot 肺組織加適量的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，放置冰上后每10 min震蕩1次，30 min后10 000g離心取上清，測定蛋白濃度后上樣。110 V恒壓分離蛋白，300 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，TBST洗膜后加入 IL-4、IL-5、IL-13、NOX2、p47phox、IκBα、NF-κB p65和β-actin一抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃過夜。d 2，TBST洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。ECL發(fā)光后AI600凝膠成像儀進(jìn)行攝像分析。

2 結(jié)果

2.1 紫云英苷對哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞的影響對各組小鼠BALF炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表明：與正常組小鼠相比，模型組小鼠炎性細(xì)胞總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.05)，紫云英苷中、高劑量組能降低哮喘小鼠炎癥細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)(P<0.05)，而且隨著紫云英苷劑量的增加，細(xì)胞總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，見Tab 1。

Tab 1 Effect of astragalin on cell numbers and compositions in BALF of asthmatic mice n=10，×107·L-1)

2.2 紫云英苷對哮喘小鼠BALF和肺組織中IL-4，IL-5和IL-13影響ELISA結(jié)果可見：與正常組相比，模型組小鼠BALF中IL-4，IL-5和IL-13含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；紫云英苷中、高劑量能夠降低哮喘小鼠IL-4，IL-5和IL-13水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Tab 2。并且ELISA結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，見Fig 1。提示紫云英苷能夠改善OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠Th2炎癥反應(yīng)。

Fig 1 Effect of astragalin on IL-4, IL-5 and IL-13 expressions in lung tissues of asthmatic mice

Tab 2 Effect of astragalin on IL-4, IL-5 and IL-13 levels in BALF of asthmatic mice ng·L-1)

2.3 紫云英苷對哮喘小鼠肺部炎癥的影響正常組小鼠氣道上皮排列整齊，氣道周圍未見炎癥細(xì)胞聚集。但模型組小鼠氣道上皮排列不規(guī)則，可見上皮細(xì)胞的腫脹和脫落，氣道周圍可見大量的炎癥細(xì)胞。而紫云英苷中、高劑量組能減少氣道周圍炎細(xì)胞數(shù)量，保持氣道上皮完整，見Fig 2。

Fig 2 Effect of astragalin on pulmonary inflammation in asthmatic mice(bar=100 μm)

2.4 紫云英苷對哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激的影響與正常組相比，模型組小鼠肺部ROS和MDA水平升高，而抗氧化酶SOD的活性明顯下降(P<0.05)；紫云英苷中、高劑量組能夠有效降低ROS和MDA的水平，提高SOD的活性(P<0.05)。提示紫云英苷能改善哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激，見Fig 3。

Fig 3 Effect of astragalin on oxidative stress in lungs of asthmatic mice

2.5 紫云英苷對NOX2和p47phox表達(dá)的影響Western blot檢測NOX2和p47phox表達(dá)，與正常組相比，模型組肺組織中NOX2和p47phox表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中、高劑量紫云英苷處理后NOX2和p47phox表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effect of astragalin on NOX and p47phox expressions in lung tissues of asthmatic mice

2.6 紫云英苷對IκBα表達(dá)的影響與正常組相比，模型組肺組織中IκBα磷酸化水平升高，總IκBα表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而中、高劑量紫云英苷能抑制IκB磷酸化，提高總IκBα，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 5 Effect of astragalin on IκB in lung tissues of asthmatic mice

2.7 紫云英苷對NF-κB p65磷酸化的影響與正常組比較，模型組肺組織中NF-κB p65磷酸化水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而中、高劑量紫云英苷能有效抑制NF-κB p65磷酸化，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 6 Effect of astragalin on NF-κB p65 phosphorylation in lung tissues of asthmatic mice

3 討論

哮喘是以氣道炎癥為特征的過敏性疾病，在其發(fā)病機(jī)制中Th2細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ型過敏起關(guān)鍵作用[5]。Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-13能促進(jìn)IgE產(chǎn)生，誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性；IL-5對嗜酸性粒細(xì)胞有明顯的增殖和趨化作用[6]。調(diào)控Th2細(xì)胞因子水平可能是防治哮喘的有效手段。在確定紫云英苷對哮喘炎癥的影響實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)紫云英苷明顯降低哮喘模型小鼠BALF嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)量；肺組織HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫云英苷能夠減輕支氣管及周圍組織炎癥細(xì)胞浸潤。進(jìn)一步觀察紫云英苷對Th2細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)紫云英苷明顯降低BALF和肺組織中IL-4、IL-5、IL-13的水平。這些結(jié)果提示，紫云英苷可能通過降低Th2細(xì)胞因子水平影響哮喘氣道炎癥。

ROS是氧化應(yīng)激的重要的組成部分，參與機(jī)體的氧化平衡。NOX是除線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的另一個ROS重要來源。NOX2(gp91phox)是NOX家族中的一個重要亞型，其組分中結(jié)構(gòu)亞基p22 phox和催化亞基NOX2形成的二聚體(即細(xì)胞色素b558)，定位在細(xì)胞膜上。p47 phox、p67 phox和p40 phox亞基構(gòu)成的復(fù)合體定位在胞質(zhì)。信號級聯(lián)觸發(fā)后，p47 phox激活使胞質(zhì)復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，并與細(xì)胞色素b558結(jié)合形成有活性NOX2，催化生成ROS[7]。產(chǎn)生的ROS可被SOD等抗氧化系統(tǒng)清除。但病理?xiàng)l件下，抗氧化系統(tǒng)難以清除過多產(chǎn)生的ROS，引起脂質(zhì)過氧化等一系列病理反應(yīng)。研究表明，哮喘存在ROS的過量產(chǎn)生，過量產(chǎn)生ROS能夠激活炎癥細(xì)胞并促使氣道上皮釋放促炎細(xì)胞因子，加劇氣道對過敏原的反應(yīng)[8]。也有研究顯示哮喘患者肺內(nèi)ROS明顯增加，并且增加的ROS破壞肺泡上皮和血管內(nèi)皮的屏障功能，參與氣道炎癥和氣道重塑[9]。敲除NOX2明顯促進(jìn)naive CD4 T向Th2細(xì)胞分化[10]，并且在NOX-/-哮喘小鼠中，Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥明顯加重[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫云英苷能明顯提高NOX2和p47phox表達(dá)，降低哮喘小鼠肺部ROS和MDA水平，提高SOD活性。暗示紫云英苷通過抑制NOX2-ROS途徑改善哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激。

NF-κB/Rel家族復(fù)合物是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子[12]。NF-κB通常以p50和p65/RelA亞基的異二聚體形式存在。正常情況下，NF-κB與抑制性κB(IκB)結(jié)合并以非DNA結(jié)合形式定位在細(xì)胞質(zhì)。各種NF-κB活化誘導(dǎo)劑刺激細(xì)胞后，IκBα絲氨酸殘基迅速磷酸化，磷酸化的IκBα被 E3泛素連接酶泛素化，隨后被26S蛋白酶體降解[11]。NF-κB從與IκBα組成的聚合體中釋放，核轉(zhuǎn)移位點(diǎn)暴露，NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并與基因啟動子中的κB元件結(jié)合激活靶基因如IL-4、IL-5、IL-13等，發(fā)揮其炎癥調(diào)控作用[13]。研究表明，灌服抗氧化劑OTC可顯著減少NF-κB向胞核的移位，降低粘附分子、趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)[14]。也有研究表明，ROS能夠促進(jìn)IκBα酪氨酸磷酸化(Tyr42)和PEST結(jié)構(gòu)域磷酸化，誘導(dǎo)NF-κB p65(Ser529)磷酸化促使NF-κB核轉(zhuǎn)位，激活NF-κB。本研究中也證明了紫云英苷降低ROS水平的同時，也能夠明顯抑制NF-κB的活化。綜上所述，紫云英苷可能通過抑制NOX2/ROS/NF-κB信號通路減輕哮喘氣道炎癥。