趙 穎，李典典，張大衛(wèi)，魏 月，馬晶軍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州 061100）

阿 散 酸（arsanilic acid，ASA）和 洛 克 沙 砷（roxarsone，ROX）等有機(jī)砷制劑被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，其添加目的為促進(jìn)生物生長(zhǎng)，并提高飼料的利用率[1-2]。由于動(dòng)物長(zhǎng)期食用添加ASA和ROX的飼料，導(dǎo)致生物體內(nèi)器官及組織中會(huì)殘留有機(jī)砷類(lèi)物質(zhì)，并通過(guò)食物鏈的作用對(duì)人體生理機(jī)能造成不同程度的破壞[3-5]。我國(guó)于2017年7月31日發(fā)布停止使用ASA和ROX作為飼料添加劑的公告，但目前對(duì)二者的研究主要集中在飼料、肉類(lèi)食品中，例如SaucedoVelez等[6]利用微波輔助萃取技術(shù)聯(lián)合高效液相色譜法對(duì)牲畜飼料中ASA、ROX及硝苯砷酸進(jìn)行痕量測(cè)定；王瑩等[7]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析雞肉中ROX殘留量及其代謝物殘留規(guī)律，而對(duì)蛋類(lèi)的研究則較少，因此有必要建立定量檢測(cè)雞蛋中的ASA和ROX的方法，為完善動(dòng)物源性食品中有害物質(zhì)的分析標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

近些年，常用于食品中有機(jī)砷制劑的萃取方法有固相萃取法（solid phase extraction，SPE）[8-9]、超聲波輔助萃取法[10-11]、加速溶劑萃取法[12-14]等，然而這些萃取方法或操作繁瑣或耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用于檢測(cè)大批量的樣品。2003年，Anastassiades等[15]首次建立了 QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective,Rugged, Safe）前處理方法用于果蔬中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)便、高效、安全，耗時(shí)較短且減少了有機(jī)溶劑使用量，近幾年被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中獸藥的殘留分析[16]。

本試驗(yàn)擬采用QuEChERS的前處理方法，聯(lián)合高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析雞蛋中痕量的ASA和ROX，以期為動(dòng)物源性食品中有機(jī)砷類(lèi)獸藥殘留提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、三氟乙酸 均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；ASA、ROX 純度≥99%，上海楚定分析儀器有限公司；多壁碳納米管 純度≥97%，中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司；QuEChERS分散固相萃取凈化試劑盒（型號(hào)：5982-5022，內(nèi)含凈化填料400 mg PSA、400 mg C18EC、45 mg GCB、1199 mg MgSO4） 美國(guó)Agilent公司；QuEChERS萃取試劑盒（型號(hào)：5982-5058，配有袋裝萃取填料MgSO4、NaCl） 美國(guó)Agilent公司；DIKMA ProElut C18填料 北京迪科馬科技有限公司；弗羅里硅土、氧化鋁填料 北京邁瑞達(dá)科技有限公司；Waters Oasis MAX固相萃取柱（規(guī)格：3cc/60 mg） 上海楚定分析儀器有限公司。

1525型高效液相色譜儀，配有2998光電二極管陣列檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）、Agilent 6460型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，配Agilent1290型液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HGC-12A型氮吹儀 恒奧科技發(fā)展有限公司；MXS型渦旋儀 美國(guó)SCILOGEX公司；Mill Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AUY120/220型電子天平 日本島津科技有限公司；FG-12型固相萃取儀器 天津市富城達(dá)科技有限公司；SHZ-111循環(huán)水真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別稱取2.5 mg（精確到0.1 mg）ASA、ROX標(biāo)準(zhǔn)品至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液待用。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 SPE法 取0.5 g（精確到0.1 mg）雞蛋樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇與5%三氟乙酸水溶液（9:1，V/V），渦旋5 min，10000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，殘?jiān)性偌尤胩崛∫? mL，重復(fù)上述步驟，合并上清液，經(jīng)旋蒸至剩余5 mL，再分別用C18柱、MAX柱和填充多壁碳納米管柱對(duì)ASA、ROX進(jìn)行凈化。試驗(yàn)中SPE裝置凈化步驟： 取5 mL甲醇活化0.5 g（精確到0.1 mg）固相萃取小柱；5 mL上清液進(jìn)行上樣；5 mL甲醇與水（1:1，V/V）淋洗雜質(zhì)；采用優(yōu)化的洗脫劑甲醇與甲酸（60:40 ，V/V）5 mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，流速控制為1 mL/min。30 ℃用氮吹吹至1 mL以下，用甲醇定容至1 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)。

1.2.2.2 基質(zhì)固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion extraction，MSPDE） 向瑪瑙研缽中準(zhǔn)確加入0.5 g（精確到0.1 mg）加標(biāo)樣品，分別用0.5 g（精確到0.1 mg）弗羅里硅土與0.5 g（精確到0.1 mg）中性氧化鋁填料進(jìn)行凈化，充分研磨5 min，使樣品與填料完全混勻，并將混合物轉(zhuǎn)移至萃取柱中。用甲醇與甲酸（60:40，V/V）作洗脫劑，在重力作用下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，隨后用10 mL離心管收集洗脫液。收集3 mL后，30 ℃氮吹吹至1 mL以下，甲醇定容至1 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行色譜分析。

1.2.2.3 QuEChERS試劑盒法 取0.5 g（精確到0.1 mg）雞蛋勻漿于50 mLQuEChERS萃取管（配有袋裝萃取填料MgSO4、NaCl）中，加入15 mL乙腈與10%三氟乙酸的甲醇溶液（1:1，V/V），渦旋5 min，再加入QuEChERS試劑盒的提取填料，10000 r/min離心5 min，移取上層液（約5 mL）于QuEChERS凈化管（內(nèi)含凈化填料400 mg PSA、400 mg C18EC、45 mg GCB、1199 mg MgSO4）中，渦旋5 min，10000 r/min離心5 min，移取上清液于氮吹管中，氮?dú)獯抵? mL以下，甲醇定容至1 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，得待測(cè)樣品。

1.2.3 HPLC檢測(cè)條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫20 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。流動(dòng)相為甲醇與0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V），等度洗脫。

1.2.4 UPLC-MS/MS檢測(cè)條件 色譜條件：流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸水溶液（A）與 甲醇（B），等度洗脫泵A與泵B（70:30，V/V），流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子掃描，錐孔電壓40 V，毛細(xì)管電壓3.5 kV，脫溶劑氣溫度350℃。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM），ASA定性離子為m/z 123.03，碰撞能量16 V，及m/z 107.16，碰撞能量為34 V；ROX定性離子為m/z 123.26，碰撞能量為25 V，及m/z 153.07，碰撞能量34 V。

1.2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 用ASA、ROX標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制濃度分別為1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法在1.00～100.00 mg/L范圍內(nèi)線性良好。將加標(biāo)濃度逐級(jí)稀釋添加于樣品中測(cè)定信噪比，以3倍噪音（RSN=3）確定檢測(cè)限（LOD）、以10倍噪音（RSN=10）確定定量限（LOQ）。

1.2.5.2 回收率和精密度 以空白基質(zhì)樣品進(jìn)行1.00、50.00、100.00 mg/L 3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，按建立的方法處理樣品，測(cè)定并計(jì)算回收率和精密度。

1.2.6 實(shí)際雞蛋樣品測(cè)定 選擇普通雞蛋、柴雞蛋做實(shí)際樣品測(cè)定，分別采集了4份來(lái)源不同的雞蛋樣品進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)樣品的來(lái)源分別是：普通雞蛋1，河北省保定市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；普通雞蛋2，河北省保定市大型超市；普通雞蛋3，河北省保定市某養(yǎng)雞場(chǎng)；普通雞蛋4，河北省保定市某集市；柴雞蛋1，河北省保定市某養(yǎng)雞場(chǎng)；柴雞蛋2，河北省保定市批發(fā)市場(chǎng)；柴雞蛋3，河北省保定市大型超市；柴雞蛋4，河北省保定市菜市場(chǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。采用Origin 2017制圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化比較前處理方法

本試驗(yàn)首次比較了SPE法、MSPDE法及QuEChERS法中不同凈化填料對(duì)目標(biāo)有機(jī)砷制劑的凈化效果，結(jié)果如圖1所示。黃佳佳等[17]研究了多壁碳納米管（MWCNTs）作為SPE填料對(duì)農(nóng)獸藥的吸附能力，結(jié)果表明其對(duì)極性化合物凈化效果較好。故本試驗(yàn)比較了C18、MAX[9]和MWCNTs填料對(duì)目標(biāo)有機(jī)砷制劑的凈化效果，結(jié)果表明，C18對(duì)兩種極性化合物吸附效果差，其具有較強(qiáng)疏水性；MAX填料吸附效果較好，但不易將目標(biāo)物洗脫下來(lái)，操作繁瑣；MWCNTs填料凈化能力明顯優(yōu)于其它填料，由于其比表面積大，吸附能力較強(qiáng)，對(duì)于極性有機(jī)化合物有較高富集能力[18]，但在目標(biāo)化合物附近易存在一定程度的色譜峰干擾，且回收率低于QuEChERS法。

在MSPDE法中，分別優(yōu)化比較弗羅里硅土（Florisil）與中性氧化鋁填料[19]凈化效果，二者均為強(qiáng)極性吸附劑，對(duì)有機(jī)砷制劑有一定吸附能力。結(jié)果表明，添加Florisil對(duì)ASA、ROX的色譜圖響應(yīng)值較高。但采用優(yōu)化的Florisil凈化樣品時(shí)，洗脫液有較多雜質(zhì)，柱凈化難度較大，除雜能力較弱。

QuEChERS法應(yīng)用QuEChERS試劑盒進(jìn)行樣品提取凈化，操作簡(jiǎn)單，省略了SPE中淋洗、洗脫等步驟，減少了分析物在轉(zhuǎn)移過(guò)程的損失，且前處理快速；同時(shí)該法相比于MSPDE法雜質(zhì)干擾小，凈化萃取柱中含有的PSA、GCB等組合填料有效去除了雞蛋樣品中蛋白、磷脂以及色素等干擾物質(zhì)，顯著降低了基質(zhì)效應(yīng)。故本試驗(yàn)選擇QuEChERS法進(jìn)行前處理操作。姜濤等[20]利用微波輔助萃取法分析測(cè)定雞蛋中ASA、ROX含量，但該儀器成本較貴，且試驗(yàn)所需優(yōu)化影響因素較多，操作較繁瑣，本試驗(yàn)中QuEChERS法裝置簡(jiǎn)單成本較低，無(wú)需復(fù)雜操作且準(zhǔn)確度較高。

凈化效果越好，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的干擾越小。由圖1可知，3種方法對(duì)于同一加標(biāo)濃度1 mg/L雞蛋樣品的凈化效果，用QuEChERS法獲得的響應(yīng)值更高，并且在同一實(shí)驗(yàn)條件下目標(biāo)物回收率均達(dá)到80%以上。為了使目標(biāo)物回收率達(dá)到最佳，需對(duì)QuEChERS法進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 三種前處理?xiàng)l件下不同凈化填料的比較Fig.1 Comparison of different purification fillers under three pretreatment conditions

2.2 QuEChERS法條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑組成及濃度的優(yōu)化 常見(jiàn)有機(jī)砷提取劑包括純水、甲醇等單一有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水按一定比例的混合溶液。本試驗(yàn)在Eom等[21]研究的基礎(chǔ)上，在同一提取比例下對(duì)不同萃取劑組成的乙腈、甲醇、水混合提取液進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，乙腈與甲醇組合時(shí)提取液較澄清，但由于雞蛋樣品中蛋白質(zhì)含量較高，而酸性條件下有利于蛋白質(zhì)沉淀，因此選擇含三氟乙酸的甲醇溶液沉淀蛋白，并優(yōu)化含三氟乙酸體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%、1%、5%、10%、15%的甲醇溶液對(duì)蛋白質(zhì)沉淀和目標(biāo)物萃取效率的影響（圖2）。結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈與10%三氟乙酸的甲醇混合溶液時(shí)提取效率較好，ASA、ROX的回收率均達(dá)到91%以上。

圖2 在相同試驗(yàn)條件下萃取劑濃度對(duì)回收率的影響Fig.2 Effect of extractant concentration on the recovery under the same experimental conditions

2.2.2 萃取劑比例的選擇 肖亞兵等[12]研究表明提取劑比例影響有機(jī)砷制劑的提取效率，故為保證萃取完全，試驗(yàn)比較了不同比例的萃取劑，如圖3所示，乙腈與10%三氟乙酸的甲醇溶液（1:1，V/V）時(shí)，可最大程度地從雞蛋樣品中提取出ASA、ROX，且基質(zhì)干擾較小。試驗(yàn)還比較提取次數(shù)對(duì)萃取率的影響，發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)過(guò)多時(shí)，萃取率反而下降，可能是由于有機(jī)砷類(lèi)物質(zhì)與基質(zhì)相互作用，導(dǎo)致目標(biāo)物有所損失，故試驗(yàn)選擇了一次提取。在采用優(yōu)化的萃取劑比例下，兩種目標(biāo)物的回收率均達(dá)到了93%以上。

圖3 相同試驗(yàn)條件下萃取劑比例對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of extractant in different proportions on the recovery under the same experimental conditions

2.3 HPLC條件的優(yōu)化

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器對(duì)ASA、ROX混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，試驗(yàn)表明在260 nm處ASA、ROX有較強(qiáng)吸收。并采用Waters Atlantis T3 5 μm色譜柱對(duì)目標(biāo)物質(zhì)ASA、ROX進(jìn)行分離。當(dāng)只采用甲醇與水時(shí)，ASA出峰時(shí)間延后，且峰的銳度不好。楊麗君等[22]研究表明在流動(dòng)相中添加一定量的三氟乙酸，有效縮短出峰時(shí)間，改善峰型。因此本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化比較了甲醇分別與體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的三氟乙酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的出峰情況，最終采用甲醇與0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V），在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)兩種目標(biāo)物的良好分離，ASA、ROX保留時(shí)間分別為3.298、6.174 min，柱效較高，峰型尖銳對(duì)稱，基線平穩(wěn)，無(wú)雜峰干擾（如圖4）。

圖4 加標(biāo)雞蛋樣品的HPLC圖Fig.4 HPLC diagram of standard egg sample

2.4 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

為了豐富檢測(cè)ASA、ROX的儀器方法，試驗(yàn)中還利用了UPLC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相中的三氟乙酸可以改善峰型，并且有助于提高質(zhì)譜負(fù)離子掃描時(shí)的離子化效率，故同樣使用甲醇與0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V）作為流動(dòng)相，等度洗脫，提高柱溫對(duì)分離無(wú)明顯效果，故確定現(xiàn)有色譜條件。

為提高分析靈敏度，選用MRM進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)ASA、ROX進(jìn)行定性離子通道分析，使定性更為準(zhǔn)確；兩種有機(jī)砷物質(zhì)呈弱酸性且易失質(zhì)子，質(zhì)譜條件選擇負(fù)離子模式，并采用電噴霧離子源，明顯降低離子干擾[23]。試驗(yàn)還對(duì)噴霧電壓、碰撞能量及離子源溫度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)而提高方法準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，以3倍噪音（RSN=3）確定LOD、以10倍噪音（RSN=10）確定LOQ。ASA的LOD為0.122 μg/kg，LOQ為0.372 μg/kg；ROX的LOD為0.254 μg/kg，LOQ為0.760 μg/kg。該方法檢測(cè)限低、靈敏度高，但檢測(cè)成本昂貴，且檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不利于向中小型企業(yè)或檢測(cè)機(jī)構(gòu)推廣。為了降低成本及考慮到方法的實(shí)用性，本試驗(yàn)使用HPLC技術(shù)分析檢測(cè)兩種目標(biāo)物。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 將ASA、ROX混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成濃度為1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定5次。以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，ASA、ROX濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在HPLC最佳檢測(cè)條件下，ASA線性方程為y=3.59×104x+1.33×105，R=0.999831；ROX線 性 方 程 為y=2.23×104x+6.59×103，R=0.999562，在 線 性 范 圍1.00～100.00 mg/L線性關(guān)系良好。根據(jù)1.2.2樣品前處理方法，以3倍噪音（RSN=3）確定LOD、以10倍噪音（RSN=10）確定LOQ。ASA、ROX的LOD分別為0.044、0.063 mg/kg；LOQ分別為0.149、0.211 mg/kg。試驗(yàn)還比較了近幾年不同分析方法的靈敏度，見(jiàn)表1。

表1 不同方法靈敏度的比較Table 1 Sensitivity comparison of different methods

2.5.2 回收率和精密度 以空白基質(zhì)樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，按建立的方法處理樣品，測(cè)定并計(jì)算回收率和精密度見(jiàn)表2。結(jié)果如下：ASA的回收率92.32%～95.95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.54%～4.92%；ROX回收率89.84%～94.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.19%～5.87%。加標(biāo)雞蛋樣品的HPLC圖見(jiàn)圖4。

表2 樣品加標(biāo)回收率及精密度Table 2 Recovery and precision of standardized samples

2.6 實(shí)際雞蛋樣品測(cè)定

檢測(cè)了普通雞蛋和柴雞蛋中ASA和ROX的含量，分別采集了4份來(lái)源不同的樣品進(jìn)行分析。試驗(yàn)中實(shí)際雞蛋樣品采集自私人養(yǎng)雞場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、菜市場(chǎng)、超市、批發(fā)市場(chǎng)和集市上，采集地點(diǎn)養(yǎng)雞場(chǎng)、市場(chǎng)可能存在缺乏監(jiān)管的現(xiàn)象，生產(chǎn)的雞蛋會(huì)殘留有ASA、ROX等飼料添加劑的問(wèn)題，但按照建立的方法制備樣品，經(jīng)HPLC分析，均未有ASA、ROX檢出（表3）。結(jié)果表明市售的雞蛋不會(huì)對(duì)消費(fèi)者構(gòu)成危害。

表3 實(shí)際樣品測(cè)定(mg/kg)Table 3 Actual sample determination(mg/kg)

3 結(jié)論

采用QuEChERS試劑盒，聯(lián)合高效液相色譜法檢測(cè)雞蛋樣品中ASA、ROX的殘留含量。該方法高效、快速、簡(jiǎn)便，具有良好的穩(wěn)定性和精密度。方法檢出限ASA、ROX分別為0.044、0.063 mg/kg；定量限分別為0.149、0.211 mg/kg；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.54%～5.87%之間。本試驗(yàn)采用的液相色譜法適用性廣，檢測(cè)成本低，且不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制[24-25]，分析速度快，可應(yīng)用于其它動(dòng)物源性食品中ASA和ROX的檢測(cè)。