李婉玉，李 越，翁 凌,2，陳守峰，陳玉磊,2，劉光明,2，曹敏杰,2,

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.海洋食品深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034）

我國是鮑魚生產(chǎn)大國，皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）是國產(chǎn)鮑魚中產(chǎn)量最高的一個品種[1]。鮑魚的可食用部分（腹足肌肉）富含多種人體必需氨基酸、呈味氨基酸及?；撬?，深受消費者的青睞[2]。

脯氨酰內(nèi)肽酶（Prolyl endopeptidase，PEP）廣泛存在于動物、植物和微生物體中，是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶[3]，能特異性水解含有脯氨酸殘基的小肽（＜33個氨基酸）[4]。在人體中，PEP通過切割含有脯氨酸殘基的神經(jīng)小肽、激素和各種細(xì)胞因子等物質(zhì)參與多種生理疾病，從而在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起廣泛的關(guān)注[5-10]。此外，微生物PEP也被廣泛研究并應(yīng)用于食品的生產(chǎn)和加工領(lǐng)域中[11-13]。近年來，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)硬骨魚的各組織中均有PEP存在，并相繼從草魚[14]、鯉魚[15]、羅非魚[16]等肌肉組織中分離純化出了天然PEP。研究表明，PEP在魚死后膠原蛋白肽的降解中具有重要作用[17-19]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，鮑魚PEP（Hdh-PEP）在性腺組織中具有較高酶活。然而，Hdh-PEP作為一種重要的內(nèi)源酶，其生理功能尚不清楚。Hdh-PEP的結(jié)構(gòu)特征、組織分布及酶學(xué)性質(zhì)等的研究以及對其生理功能的研究十分必要。但由于天然PEP在鮑魚肌肉中含量極低，分離純化難度大。因此，本文利用基因工程菌株體外高效表達獲得重組Hdh-PEP并制備其多克隆抗體，以期為進一步了解該酶的性質(zhì)和生理功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）平均重量約60 g，購買于廈門市集美菜市場；底物Suc-Gly-Pro-MCA、抑制劑SUAM-14746、ZPP 日本Peptide Institute公司；酵母粉、蛋白胨 英國Oxoid公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、E-64、苯甲脒（Benzamidine）、亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）、卡那霉素（Kana+）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 美國Sigma公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量 立陶宛Fermentas。

PT2100組織搗碎機 瑞典Kinematica；Protein A Sepharose親和層析（BTR202Q-Y1） 中國博爾西；Ni-NTA柱 北京TransGen；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco；熒光定量PCR儀 美國ABI；Avanti JA-26.5高速冷凍離心機 美國Beckman；超聲波細(xì)胞破碎儀 美國SCONICS；化學(xué)發(fā)光熒光成像儀 美國AlphaInnotech；微量蛋白核酸測定儀德國NanoDrop公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑魚不同組織中Hdh-PEP酶活力檢測 采用熒光底物法檢測不同組織中Hdh-PEP酶活力[20-21]。反應(yīng)體系：取新鮮鮑魚的腹足觸角、肝胰腺、腹足肌肉、鰓、外套膜、性腺和血液各5 g，將各種組織用剪刀剪碎后放入4倍體積的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）（pH6.0）進行組織搗碎，8000 r/min，20 min離心后取100 μL上清溶液與850 μL 20 mmol/L PBS（pH6.0）混勻后再加入50 μL濃度為10 μmol/L的底物（Suc-Gly-Pro-MCA），在其最適溫度20 ℃[22]下孵育30 min后，加入1.5 mL終止液（甲醇：異丙醇：超純水，35：30：35（v/v/v））終止反應(yīng)?？瞻讓嶒炗谜麴s水代替反應(yīng)體系中的酶液。用熒光分光光度計（FP-8200）在激發(fā)波長380 nm和發(fā)射波長450 nm下，分別測定反應(yīng)體系和空白體系的熒光強度I反應(yīng)和I空白，Hdh-PEP酶活力用ΔI=I反應(yīng)-I空白表示。

1.2.2 Hdh-PEP的重組表達及純化 由于天然PEP在鮑魚組織中含量極低，且分離純化難度大[23]。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了Hdh-PEP表達菌株[22]。將菌株接種至含有50 μg/mL Kana+的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基（1 L），在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)速200 r/min下培養(yǎng)6 h至OD600值為0.6后，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑進行低溫低轉(zhuǎn)速（16 ℃，100 r/min，15 h）誘導(dǎo)表達。將誘導(dǎo)后的菌液離心收集（8000 r/min，4 ℃，20 min），棄去上清液后，使用20 mL菌體裂解液（20 mmol/L PBS，10 mmol/L咪唑，1 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH6.0）重懸細(xì)菌沉淀。將重懸均勻的細(xì)菌懸浮液在冰浴中使用超聲波細(xì)胞破碎儀進行破碎，然后將全菌液離心（8000 r/min，4 ℃，25 min），取上清。用0.2 μm的聚醚砜膜對上清過濾后，以1 mL/min的流速上樣于已用平衡緩沖液（20 mmol/L PBS，10 mmol/L咪唑，pH6.0）處理的Ni-NTA柱。完成上樣后，使用流洗緩沖液（20 mmol/L PBS，50 mmol/L咪唑，pH6.0）流洗3 h以除去雜蛋白。換用洗脫緩沖液（20 mmol/L PBS，250 mmol/L咪唑，pH6.0）進行目的蛋白洗脫，使用自動收集器以每管2.5 mL進行收集。純化得到Hdh-PEP溶液經(jīng)20 mmol/L PBS（pH6.0）透析以去除咪唑，純化及透析過程在低溫（4 ℃）下進行。

1.2.3 Hdh-PEP純度及濃度測定 取10 μL Hdh-PEP（1.0 mg/mL）溶液及3 μL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量（Marker，26～130 kDa）上樣于12%的凝膠進行SDS-PAGE分析，以確定Hdh-PEP的分子量及純度。Hdh-PEP濃度采用Bradford法進行檢測，用PBS緩沖液（pH6.0）配制不同濃度的牛血清白蛋白溶液（100～500 μg/mL），以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 Hdh-PEP酶活力測定 按照1.2.1中熒光底物法檢測重組的Hdh-PEP酶活力。

1.2.5 PEP二級結(jié)構(gòu)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得不同物種的PEP氨基酸序列，下載其FASTA格式文件，登錄ClustalW在線服務(wù)器（http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進行氨基酸序列比對[24]。使用ESPrint 3.0在線服務(wù)器（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）對ClustalW分析產(chǎn)生的序列比對結(jié)果進行二級結(jié)構(gòu)對比分析[25]。

1.2.6 酶動力學(xué)參數(shù)測定 將50 μL不同濃度的底物（Suc-Gly-Pro-MCA）和50 μL Hdh-PEP（2.5 mg/mL）加入到900 μL磷酸緩沖液（25 mmol/L，pH6.0）中混合均勻后，在20 ℃下反應(yīng)5 min，加入1.5 mL終止液終止反應(yīng)，按照1.2.1方法對酶活力進行測定。以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/ν為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖[10]，并計算Hdh-PEP酶動力學(xué)參數(shù)：米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax和催化常數(shù)kcat。

1.2.7 表面疏水性的測定 通過1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法分析不同pH和溫度對酶的表面疏水性的影響。蛋白質(zhì)的表面疏水性取決于其三級結(jié)構(gòu)中疏水性氨基酸的暴露程度，ANS熒光探針能夠高親和性結(jié)合蛋白疏水區(qū)，結(jié)合后熒光增強[26]，因此，用熒光強度的變化反映蛋白表面疏水性的變化。在96孔酶標(biāo)板中，向5排反應(yīng)孔中加入200 μL Hdh-PEP（0.1 mg/mL，pH6.0），再加入4 μL ANS溶液（8 mmol/L），混合均勻后分別在20、30、40、50、60 ℃下避光反應(yīng)20 min。在另一個96孔酶標(biāo)板中，向6排反應(yīng)孔中加入4 μL ANS溶液（8 mmol/L）和200 μL用不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0）緩沖液配制的Hdh-PEP（0.1 mg/mL）后，混合均勻，于20 ℃下避光反應(yīng)20 min。使用酶標(biāo)儀對反應(yīng)液進行全波長掃描（激發(fā)波長：390 nm，發(fā)射波長：425～600 nm）以獲得熒光光譜值。

1.2.8 抑制劑對Hdh-PEP酶活力的影響 反應(yīng)體系：將890 μL 25 mmol/L的PBS（pH6.0）中、50 μL Hdh-PEP（2.5 mg/mL）及10 μL不同種類的抑制劑（SUAM-14746、ZPP、PMSF、EDTA、EGTA、E-64、Benzamidine、Leupeptin），抑制劑終濃度分別為5、5、5、2、5、5、1、5 μmol/L。在室溫下孵育30 min后，加入50 μL底物（Suc-Gly-Pro-MCA，10 μmol/L），20 ℃下孵育30 min后立即加入1.5 mL終止液終止反應(yīng)，檢測剩余酶活力?？瞻捉M樣品以蒸餾水代替抑制劑。

1.2.9 兔抗Hdh-PEP多克隆抗體的制備

1.2.9.1 免疫 將純化后的Hdh-PEP濃度調(diào)整至1.0 mg/mL，取200 μL Hdh-PEP（0.2 mg）與等體積的弗氏完全佐劑充分混合后對成年雄兔進行初次免疫，采用皮下多點注射方式[27]。每間隔一周進行三次加強免疫，免疫過程委托廈門大學(xué)實驗動物中心完成。免疫完成后取少量兔子耳朵動脈血清檢測其效價及特異性，達標(biāo)后進行頸動脈取全血。取得的全血在4 ℃下靜止4 h后，在4 ℃、10000 r/min下離心15 min，收集上層血清。

1.2.9.2 多克隆抗體IgG的純化 采用Protein A Sepharose親和層析柱對血清中的抗Hdh-PEP多克隆抗體IgG進行純化[16]。用0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液對層析柱進行平衡，取血清與等體積的0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液混勻后，上樣于親和層析柱。用10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）進行流洗，直至流洗液A280＜0.05，以除去雜蛋白。然后，用0.1 mol/L Glycine-HCl（pH3.0）緩沖液進行洗脫，將純化得到的IgG進行SDS-PAGE分析。

1.2.9.3 多克隆抗體的特異性分析 采用Western blotting方法對鮑魚腹足肌肉中的Hdh-PEP進行檢測。取5 g新鮮鮑魚腹足肌肉，加10倍體積的10 mmol/L PBS（pH6.0）進行組織搗碎，10000 r/min離心30 min，取上清。經(jīng)SDS化后上樣于12%的電泳膠，電泳完成后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素模（NC膜）上。用5%脫脂奶對NC膜進行封閉，隨后進行三次Tris-HCl-吐溫-20洗滌緩沖液（TBST）洗膜，每次間隔5 min。用TBST將純化得到的IgG稀釋（1:100000）后作為一抗，與NC膜在室溫下輕搖45 min。孵育完成后，用TBST溶液洗滌5次，每次5 min。將NC膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體共孵育45 min后，用TBST溶液充分洗凈。將NC膜與ECL顯影液反應(yīng)2 min，使用化學(xué)發(fā)光熒光成像儀顯示結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值，采用Excel2010對數(shù)據(jù)進行處理并進行誤差分析。制圖及排版在WPS 2019 PowerPoint和Adobe Illustrator CS5上完成。

圖1 Hdh-PEP在鮑魚不同組織中的相對酶活Fig.1 Relative enzymatic activity of Hdh-PEP in different tissues

2 結(jié)果與分析

2.1 Hdh-PEP在鮑魚各組織中的酶活分布情況

為了檢測鮑魚各組織中Hdh-PEP的酶活力情況，以Suc-Gly-Pro-MCA為底物，檢測鮑魚7個主要組織（腹足觸角、肝胰腺、腹足肌肉、鰓、外套膜、性腺和血液）中Hdh-PEP的酶活。如圖1所示，在鮑魚性腺中Hdh-PEP酶活性最高，肝胰腺、腹足肌肉次之，血液中的酶活力最低。據(jù)Ohta等[28]報道，小鼠在發(fā)情期子宮和卵巢中的PEP酶活性有顯著增加的變化趨勢，揭示了卵巢激素循環(huán)水平與PEP的活性密切相關(guān)。此外，據(jù)Yoshida等[29]報道，PEP的特異性抑制劑能抑制鯡魚精子激活蛋白的酶活力和精子活力。這些研究表明，PEP除了與人的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，也參與其他生物的生殖繁育過程。目前，PEP在貝類動物鮑魚中的作用尚不清楚，但其在鮑魚性腺組織中具有較高酶活，因此推測PEP在鮑魚的生殖繁育過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 Hdh-PEP的體外重組表達及純化

SDS-PAGE分析顯示，Hdh-PEP表達菌株經(jīng)低溫培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達后，在全菌液中出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶（約85 kDa），表明產(chǎn)生了大量重組Hdh-PEP（圖2，泳道1），其中一部分以可溶狀態(tài)存在于上清液中（圖2，泳道2），將上清液上樣于Ni-NT柱進行純化后得到單一條帶（圖2，泳道3），表明重組Hdh-PEP的純度達到95%以上。從1 L培養(yǎng)液中可純化得到Hdh-PEP 4.06 mg，總活力26.47 U，比活力為6.52 U/mg。

圖2 純化Hdh-PEP的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified Hdh-PEP

2.3 二級結(jié)構(gòu)差異性分析

為了解不同來源PEP二級結(jié)構(gòu)的差異性，本文中選擇了紋緣盔孢傘（Galerina marginata，Gm-PEP）、豬（Porcine，Pc-PEP）、人（Homo sapiens，Hm-PEP）、黃色粘球菌（Myxococcus xanthus，Mx-PEP）四個物種的PEP與Hdh-PEP的氨基酸序列及二級結(jié)構(gòu)進行比較分析。結(jié)果如圖3所示，在β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域（藍色虛線）中，只有少數(shù)氨基酸（紅色突出顯示）是相同的，而在催化結(jié)構(gòu)域（藍色實線）中相同的氨基酸數(shù)量占比明顯較多。其中，在催化結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)三個高度保守的PEP特異性氨基酸序列：Seq 1：K-DG-T-K/R-I-P、Seq 2：Y-G-Y-G-G-F、Seq 3：I-R-G-GE-Y/F。這表明，PEP的催化結(jié)構(gòu)域比β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域更保守。另外，通過DNAMAN軟件計算得到Hdh-PEP與其它4種PEP的氨基酸序列同源性分別為63.80%、63.24%、22.95%和36.12%。圖3中10個α-螺旋結(jié)構(gòu)（以黑色線圈表示）分布在催化區(qū)域中，28個β-折疊結(jié)構(gòu)（以黑色箭頭表示）分布在β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域中。盡管它們的氨基酸序列相似性存在較大差異，但二級結(jié)構(gòu)特征是非常相似的。

圖3 PEP的氨基酸序列和二級結(jié)構(gòu)比對Fig.3 Amino acid sequence and secondary structure comparison of PEPs

2.4 Hdh-PEP酶動力學(xué)分析

以Suc-Gly-Pro-MCA為底物，通過動力學(xué)方法測定酶分解底物的米氏常數(shù)和催化常數(shù)。固定酶濃度，選取不同濃度的Suc-Gly-Pro-MCA為底物，測定酶催化底物水解的反應(yīng)初速率。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，得到圖4。由此得出，Hdh-PEP分解該底物的米氏常數(shù)Km為5.32 μmol/L，其催化常數(shù)kcat值為15.7 s-1。

圖4 Hdh-PEP的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.4 Lineweaver-Burk double reciprocal of Hdh-PEP

2.5 Hdh-PEP表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性取決于其三級結(jié)構(gòu)中疏水性氨基酸的暴露程度，因此疏水性的變化可以用來反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。pH和溫度是影響蛋白酶催化活性的重要因素之一，因此通過ANS疏水熒光探針法檢測了pH和溫度對Hdh-PEP表面疏水性的影響，以了解Hdh-PEP的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

如圖5A顯示，Hdh-PEP在490 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，隨著pH升高，Hdh-PEP的熒光強度逐漸下降。表明pH越高，Hdh-PEP的表面疏水性越弱。為了進一步研究pH對Hdh-PEP疏水性的影響，檢測了不同質(zhì)量濃度的Hdh-PEP熒光強度的變化（激發(fā)波長：390 nm，發(fā)射波長：470 nm）。以Hdh-PEP的蛋白濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)進行作圖，獲得在不同pH下Hdh-PEP的疏水指數(shù)（斜率）（圖5B）。結(jié)果顯示，pH＜6時，Hdh-PEP的疏水指數(shù)較大，而pH＞6時，Hdh-PEP的疏水指數(shù)較小，表明Hdh-PEP表面疏水性易受低酸性環(huán)境（pH＜6）的影響，即當(dāng)pH＜6時Hdh-PEP的空間穩(wěn)定性較差。

如圖5C所示，隨著溫度逐漸升高，熒光強度逐漸增強。這可能是高溫引起Hdh-PEP三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更多疏水性氨基酸殘基暴露的原因。為了進一步確定溫度對Hdh-PEP疏水性的影響，檢測了0.01～1.00 mg/mL濃度范圍中Hdh-PEP在不同溫度下熒光強度的變化。如圖5D所示，隨著溫度的升高，Hdh-PEP的疏水性指數(shù)（斜率）逐漸變大，表明溫度越高，Hdh-PEP的表面疏水性增加，即空間結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。

2.6 不同蛋白酶抑制劑對Hdh-PEP酶活力的影響

將純化后的重組Hdh-PEP與不同的蛋白酶抑制劑于20 ℃共孵育30 min后，測定重組Hdh-PEP的剩余酶活力，以分析不同蛋白酶抑制劑對Hdh-PEP酶活力的影響。結(jié)果如表1所示。

由表1可知，SUAM-14746和ZPP作為PEP的特異性抑制劑對Hdh-PEP酶活力具有較好的抑制作用，抑制率分別為94.3%和93.1%。PMSF是絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑，其對Hdh-PEP酶活力具有一定程度的影響，但抑制率只有41.5%，相對較弱。而其它絲氨酸蛋白酶抑制劑（Benzamidine和Leupeptin）對酶活性幾乎無抑制作用。此外，EDTA、EGTA等金屬蛋白酶抑制劑以及半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64對Hdh-PEP酶活力同樣幾乎無抑制作用。Hdh-PEP與草魚PEP、鯉魚PEP相似，均能被絲氨酸蛋白酶抑制劑不同程度地抑制[14,30]。

2.7 Hdh-PEP多克隆抗體的制備及檢測

為了獲得特異性及效價良好的Hdh-PEP多克隆抗體，本文制備了兔抗Hdh-PEP多克隆抗體。SDS-PAGE分析表明，經(jīng)過純化后的兔血清溶液中顯示出50和25 kDa兩個條帶（圖6A），即IgG抗體的重鏈和輕鏈。為了檢測該多克隆抗體的特異性，將純化后的IgG作為一抗對鮑魚腹足肌肉中的天然Hdh-PEP進行Western blotting分析。結(jié)果如圖6B所示，在72～95 kDa范圍內(nèi)檢測到一條清晰的蛋白條帶，與Hdh-PEP分子量（85 kDa）接近。該結(jié)果表明，兔抗Hdh-PEP多克隆抗體能在鮑魚肌肉組織粗蛋白上清液中與天然Hdh-PEP特異結(jié)合。

圖5 pH和溫度對Hdh-PEP表面疏水性的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on the surface hydrophobicity of Hdh-PEP

表1 蛋白酶抑制劑對Hdh-PEP的作用Table 1 Effect of proteinase inhibitors on theactivity of Hdh-PEP

3 結(jié)論

皺紋盤鮑脯氨酰內(nèi)肽酶（Hdh-PEP）分布于鮑魚各組織中，在性腺中酶活力最高，這表明Hdh-PEP與鮑魚生殖、免疫等生理活動密切相關(guān)。重組Hdh-PEP分子質(zhì)量為85 kDa，比活力為6.52 U/mg。Hdh-PEP與紋緣盔孢傘、豬、人、黃色粘球菌PEP的序列同源性分別為63.80%、63.24%、22.95%和36.12%。從二級結(jié)構(gòu)比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hdh-PEP的催化結(jié)構(gòu)域比β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域更保守。Hdh-PEP的表面疏水性與pH、溫度密切相關(guān)，隨著pH下降、溫度升高，表面疏水性增加，空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。與魚類PEP相似，PEP特異性抑制劑對SUAM、ZPP對Hdh-PEP酶活力抑制率分別為94.3%和93.1%。兔抗Hdh-PEP多克隆抗體可特異檢測鮑魚肌肉蛋白中天然Hdh-PEP的存在，為后續(xù)從蛋白水平研究Hdh-PEP提供了條件。

圖6 Hdh-PEP多克隆抗體的SDS-PAGE分析和Hdh-PEP的Western blotting分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of Hdh-PEP polyclonal antibody and western blotting analysis of Hdh-PEP