馬尚玄，郭剛軍, ，黃克昌，胡小靜，付鎵榕，徐 榮，李志燕，鄒建云

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100；2.文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院，云南文山 663000）

澳洲堅(jiān)果（Macadamiaspp.），又名昆士蘭栗、夏威夷果、巴布果、澳洲胡桃等，其可食部分為果仁，既可生吃、又可烤制；烤制后酥脆細(xì)膩，味美可口，風(fēng)味極佳，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，在國(guó)際市場(chǎng)上極受青睞，被譽(yù)為“堅(jiān)果之王”[1-2]。其脂肪含量高達(dá)65%～80%，蛋白質(zhì)含量8%～20%，還含有相當(dāng)量的碳水化合物、多酚、黃酮、甾醇、生育酚、角鯊烯等營(yíng)養(yǎng)與功能成分[3-4]。近年來(lái)，我國(guó)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)墾局統(tǒng)計(jì)，2018年全國(guó)澳洲堅(jiān)果種植面積451.81萬(wàn)畝。隨著《云南省澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)規(guī)劃（2013-2020）》的實(shí)施，我國(guó)澳洲堅(jiān)果帶殼果產(chǎn)量有望達(dá)到100萬(wàn)噸/年，澳洲堅(jiān)果油將成為重要的產(chǎn)品形式[5]。而榨油后的副產(chǎn)物澳洲堅(jiān)果粕含有較高含量的蛋白質(zhì)，通過(guò)酶法及相關(guān)分離技術(shù)制備多肽是提高其利用率的有效途徑之一[6]。

微生物滋生或污染是影響食品保質(zhì)期的主要因素，工業(yè)上，通常使用含有化學(xué)成分的防腐劑來(lái)抑制微生物的生長(zhǎng)，延緩產(chǎn)品的腐敗[7]。隨著人類健康與安全意識(shí)的增強(qiáng)，天然抑菌防腐物質(zhì)成為世界各國(guó)研究的熱點(diǎn)[8]?？咕嚯挠捎谄涮烊坏目咕阅芎洼^弱的細(xì)菌耐藥性，可替代化學(xué)防腐劑或抗生素等防腐抗菌藥物，如Nisin一樣作為天然防腐劑應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域[9]。本文利用液壓壓榨后的澳洲堅(jiān)果粕蛋白質(zhì)含量高（30%左右）、未變性等特點(diǎn)，制備并尋找一種或多種多肽作為天然食品保鮮劑[10]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，功能多肽的制備可通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)適當(dāng)酶解獲得[11-12]，相對(duì)于化學(xué)法，其具有反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短、產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[13]。多肽的生物活性是由其氨基酸的構(gòu)成決定的，具體而言是氨基酸的種類、數(shù)量及排列順序。在多肽制備時(shí)，酶的種類和反應(yīng)條件決定著其相對(duì)分子質(zhì)量大小和氨基酸序列[14]。目前，利用蛋白酶水解法制備澳洲堅(jiān)果多肽已有文獻(xiàn)報(bào)道[6,15]，但有關(guān)其不同分子量多肽的分布、成分構(gòu)成與生物活性的研究尚不多見(jiàn)。本研究利用堿性蛋白酶水解制備澳洲堅(jiān)果多肽，分級(jí)透析分離不同分子量的多肽，研究其氨基酸組成與抑菌活性，以期為澳洲堅(jiān)果的深度利用和開(kāi)發(fā)新型天然食品防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕 西雙版納云墾澳洲堅(jiān)果科技開(kāi)發(fā)有限公司；堿性蛋白酶（10萬(wàn)U/g） 廣西南寧東恒華道生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉 上海魯微科技有限公司；透析袋

美國(guó)聯(lián)合碳化Viskase公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氯化鈉等試劑 均為分析純。

RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA集團(tuán)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 上海科析試驗(yàn)儀器廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精風(fēng)儀器有限公司；TD5AWS型離心機(jī)湖南湘儀 離心機(jī)儀器有限公司；YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；150T型多功能粉碎機(jī) 上海比朗儀器有限公司；AL型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；牛津杯 廣州市昕迪實(shí)驗(yàn)器材有限公司；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 澳洲堅(jiān)果多肽的制備 本研究澳洲堅(jiān)果多肽的制備工藝及酶解條件參考文獻(xiàn)[6]，具體如下：液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕經(jīng)溫度50 ℃烘干，粉碎，過(guò)60目篩，加入適量的蒸餾水?dāng)嚢枵{(diào)漿，冷卻至酶作用的適合溫度，加入適量的堿性蛋白酶，調(diào)pH至恒定，進(jìn)行一定時(shí)間恒溫酶水解，反應(yīng)結(jié)束后，采用沸水滅酶10 min，冷卻至室溫，用離心機(jī)于轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下離心10 min，取其上清液，調(diào)pH為4.6（蛋白質(zhì)等電點(diǎn)），靜置30 min后再于轉(zhuǎn)速4000 r/min條件下離心10 min，取其上清液，真空濃縮，冷凍干燥，得澳洲堅(jiān)果多肽（MNP-0）。酶解條件為：酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間3.5 h，底物濃度110 g/L，酶解pH8.0，加酶量2400 U/g（占堅(jiān)果粕質(zhì)量）。

1.2.2 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的分離 配制40mg/mL的澳洲堅(jiān)果多肽（MNP-0）溶液，然后采用截留分子量20000、10000、5000、3000、2000、1000、500與300 Da的透析袋逐級(jí)分離，得到MNP-1（10000 Da＜Mr＜20000 Da）、MNP-2（5000 Da＜Mr＜10000 Da）、MNP-3（3000 Da＜Mr＜5000 Da）、MNP-4（2000 Da＜Mr＜3000 Da）、MNP-5（1000 Da＜Mr＜2000 Da）、MNP-6（500 Da＜Mr＜1000 Da）、MNP-7（300 Da＜Mr＜500 Da）、MNP-8（Mr＜300 Da）8種澳洲堅(jiān)果多肽組分，并以MNP-0為對(duì)照，測(cè)定其多肽含量，真空濃縮，冷凍干燥。

1.2.3 多肽與氨基酸組成的測(cè)定 多肽含量測(cè)定：雙縮脲法[16]，以標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白為標(biāo)樣，采用最小二乘法做線性回歸，得酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度C（mg/mL）與吸光度A關(guān)系曲線的回歸方程：C=0.0288A+0.0003，決定系數(shù)R2=0.9999。然后取澳洲堅(jiān)果多肽液1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，室溫下放置30 min，在540 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算得出樣品中的多肽含量；計(jì)算多肽質(zhì)量占比，參照文獻(xiàn)[6]中公式計(jì)算。

氨基酸組成測(cè)定：按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定，并參考文獻(xiàn)[17]，利用氨基酸分析儀測(cè)定澳洲堅(jiān)果多肽組分的氨基酸組成。

1.2.4 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽抑菌活性測(cè)定

1.2.4.1 菌懸液的制備 細(xì)菌菌懸液的制備：將供試細(xì)菌接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于溫度（36±1） ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h活化。取活化好的菌種在無(wú)菌條件下，分別挑取一環(huán)放入10 mL的無(wú)菌水中，混勻，采用光電比濁法測(cè)定OD560nm，配制活菌數(shù)1.45×108CFU/mL的細(xì)菌菌懸液，備用。

真菌菌懸液的制備：將供試白色念珠菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上、黑曲霉接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)上，于溫度（26±1） ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h活化，分別挑取一環(huán)真菌孢子或菌絲，放入10 mL的無(wú)菌水中，混勻，備用[18]。

1.2.4.2 牛津杯法測(cè)定 將菌懸液均勻涂布在含有培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)平板分3次涂布，每次涂1/3，均勻涂布后，取3個(gè)已滅菌的牛津杯，均勻等距的放置于平板上，呈正三角形排列，分別取0.2 mL 4 mg/mL的多肽液樣品加入牛津杯中，在（4±1） ℃溫度下擴(kuò)散處理4 h，細(xì)菌在溫度37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌在溫度27 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[19-20]。

1.2.4.3 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 分別取1 mL不同分子量多肽液放入平板中，加入1 mL無(wú)菌水，混勻，然后再取1 mL放入下一個(gè)平板，加入1 mL無(wú)菌水混勻，依次重復(fù)上述操作，直到稀釋到最小值。然后分別倒入培養(yǎng)基，輕微振蕩，使多肽液與培養(yǎng)基充分混勻，待冷卻后，分別取0.2 mL懸菌液涂布，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，確定出無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度，然后在此濃度上以0.5 mg/mL或1.0 mg/mL濃度梯度遞減，倒入培養(yǎng)基培養(yǎng)，重復(fù)上述操作，確定不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的最低抑菌濃度[21-22]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件處理，應(yīng)用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為顯著性差異。用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的質(zhì)量分布

由圖1可知，不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽具有不同的質(zhì)量占比，其中，多肽MNP-8的質(zhì)量占比最高，為25.09%，與其他分子量的多肽存在顯著性差異（P＜0.05），其次是多肽MNP-4與MNP-6，其占比分別為19.11%與18.52%，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。多肽質(zhì)量占比最低的是多肽MNP-1與MNP-2，分別為5.60%與5.20%，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，多肽的分子量大小是影響蛋白肽生物活性的關(guān)鍵因素，分子量越小抗菌活性越高。由此推斷，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8分子量最低，質(zhì)量占比最高，其可能具有較好的抑菌活性。

圖1 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽質(zhì)量占比Fig.1 Quality proportions of Macadamia nut polypeptides different with different molecular weight

2.2 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的氨基酸組成

具有抗菌作用的肽類一級(jí)結(jié)構(gòu)比較相似，N端富含賴氨酸和精氨酸等陽(yáng)離子型氨基酸，C端富含丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等非極性氨基酸，中間部分則富含脯氨酸[25]，在β折疊型結(jié)構(gòu)類與伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類中的抗菌肽均富含脯氨酸[26]。由表1可知，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8中含有與抗菌作用有關(guān)的丙氨酸、纈氨酸與亮氨酸占比顯著高于其它多肽（P＜0.05），分別為3.38%、2.42%與4.67%。多肽MNP-8與MNP-3的澳洲堅(jiān)果多肽中所含有的脯氨酸占比最高，兩者無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與多肽MNP-0及其他分子量多肽存在顯著性差異（P＜0.05），多肽MNP-8的脯氨酸占比為4.39%。澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8含有的賴氨酸占比相對(duì)較高，僅低于多肽MNP-6，與多肽MNP-0無(wú)顯著性差異（P＞0.05），為5.51%。氨基酸的疏水性可直接影響抗菌肽對(duì)菌體細(xì)胞膜的透化作用，且肽的脂質(zhì)體滲透性和殺菌活性隨著疏水性的增加而增加[27]，總疏水性氨基酸占比越高，多肽的抑菌活性越強(qiáng)。澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8的總疏水性氨基酸占比最高，與多肽MNP-0及其他分子量多肽存在顯著性差異（P＜0.05），為26.92%，其次為多肽MNP-7，占比為22.95%，與其他分子量多肽存在顯著性差異（P＜0.05），多肽MNP-1占比最低，僅為13.97%。由此推斷，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸與脯氨酸及總疏水性氨基酸占比最高，其可能具有較高的抑菌活性。

表1 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的氨基酸組成（%）Table 1 Amino acid composition of Macadamia nut polypeptides with different molecular weight (%)

表2 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的抑菌活性Table 2 Antibacterial activities of Macadamia nutpolypeptides with different molecular weight

2.3 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的抑菌活性

由表2可知，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-0與不同分子量多肽對(duì)受試的細(xì)菌和真菌呈現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中，多肽MNP-8對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌與白色念珠菌抑菌活性最好，抑菌圈直徑分別為15.92、14.67、13.70、16.98與12.47 mm，與多肽MNP-0及其他分子量多肽存在顯著性差異（P＜0.05）；其與多肽MNP-1對(duì)黑曲霉的抑菌活性最好，抑菌圈直徑分別為8.60與7.83 mm，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。其次，多肽MNP-0對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌與白色念珠菌抑菌活性較好，抑菌圈直徑分別為11.83、11.25、9.92與8.29 mm，優(yōu)于除多肽MNP-8以外的樣品；其與多肽MNP-3對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性較好，抑菌圈直徑分別為11.58與10.31 mm，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），優(yōu)于除多肽MNP-8以外的樣品；多肽MNP-2與MNP-5對(duì)黑曲霉抑菌活性較好，抑菌圈直徑分別為6.45與6.32 mm，兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），優(yōu)于除多肽MNP-8以外的樣品。其他分子量多肽樣品抑菌效果相對(duì)較差，多肽MNP-4與MNP-7對(duì)金黃色葡萄球菌，多肽MNP-1對(duì)鼠傷寒沙門氏菌，多肽MNP-2對(duì)大腸埃希氏菌，多肽MNP-5對(duì)銅綠假單胞菌，多肽MNP-3、MNP-4與MNP-7對(duì)黑曲霉均無(wú)抑菌效果。由上述分析可知，不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽具有不同的抑菌活性，這可能與它們擁有不同分子量、抗菌氨基酸組成及結(jié)構(gòu)特征等密切相關(guān)，其可以破壞微生物細(xì)胞膜的通透性，瓦解細(xì)胞壁，抑制蛋白質(zhì)合成，引起其能量代謝系統(tǒng)紊亂，從而發(fā)揮抑菌作用[28]。宋惠平等[29]將條斑紫菜水溶性蛋白胃蛋白酶水解物分成Mr＜5 kDa、5 kDa＜Mr＜10 kDa、10 kDa＜Mr＜50 kDa、50k Da＜Mr＜100 kDa和Mr＞100 kDa 5種不同分子量多肽組分，研究發(fā)現(xiàn)分子量最小的Mr＜5 kDa多肽組分對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性最強(qiáng)；蔣雨晴等[30]利用胃蛋白酶水解卵白蛋白制備多肽，采用超濾技術(shù)將其分為Mr＞10 kDa、3 kDa＜Mr＜10 kDa、Mr＜3 kDa 3種不同分子量的多肽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子量最小的Mr＜3 kDa多肽組分對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌具有最好的抑菌作用，這和本研究結(jié)果一致。綜合來(lái)看，相同濃度澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8對(duì)各受試菌抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好；多肽MNP-0的抑菌效果次之。因此，本文進(jìn)一步對(duì)其最低抑菌濃度（MIC）進(jìn)行了研究。

2.4 澳洲堅(jiān)果多肽最低抑菌濃度（MIC）

2.4.1 多肽MNP-8最低抑菌濃度（MIC） 由表3、表4可知，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8對(duì)不同類型的微生物均有不同程度的抑制作用，受試細(xì)菌中受抑制作用最為明顯的是銅綠假單胞菌，其MIC為3.5 mg/mL，其次是金黃色葡萄球菌，MIC為4.0 mg/mL，相對(duì)較差的是大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，MIC分別為4.5和5 mg/mL。多肽MNP-8對(duì)受試真菌白色念珠菌與黑曲霉抑菌效果相對(duì)較差，其對(duì)白色念珠菌的MIC為18.0 mg/mL；而在0～28 mg/mL多肽濃度范圍內(nèi)，均有黑曲霉菌生長(zhǎng)，達(dá)不到最低抑菌濃度。研究證實(shí)天然抗菌活性多肽具有活性強(qiáng)、廣譜殺菌、易被人體消化水解且無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)食品中的多種微生物都有很強(qiáng)的殺滅作用，是一類新型的生物防腐劑[31-32]。在食品加工中添加抗菌活性多肽可減少化學(xué)防腐劑的使用量，減輕熱處理程度，且能保證食品的營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味，延長(zhǎng)貨架期，在果汁、蔬菜、水果、食用菌、牛奶、冷鮮肉中保鮮效果良好，具有替代化學(xué)防腐劑的潛能，擁有廣闊的應(yīng)用前景[33]。

表3 澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8對(duì)細(xì)菌的MICTable 3 MIC of bacterias of Macadamia nut polypeptide MNP-8

表4 澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8對(duì)真菌MICTable 4 MIC of fungus of Macadamia nut polypeptide MNP-8

2.4.2 多肽MNP-0最低抑菌濃度（MIC） 由表5、表6可知，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-0對(duì)細(xì)菌金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌與銅綠假單胞菌等細(xì)菌的抑菌效果相對(duì)較好，其MIC分別為20.0、22.0、19.0、18.0 mg/mL。其對(duì)真菌白色念珠菌與黑曲霉的抑菌活性較差，對(duì)白色念珠菌的MIC為28.0 mg/mL，而在0～33 mg/mL濃度范圍內(nèi)，均有黑曲霉菌生長(zhǎng)，達(dá)不到最低抑菌濃度。澳洲堅(jiān)果多肽MNP-0對(duì)除黑曲霉外的各種細(xì)菌和真菌的抑菌效果低于多肽MNP-8。

表5 澳洲堅(jiān)果多肽MNP-0對(duì)細(xì)菌的MICTable 5 MIC of bacterias of Macadamia nut polypeptide MNP-0

表6 澳洲堅(jiān)果多肽MNP-0對(duì)真菌的MICTable 6 MIC of fungus of Macadamia nut polypeptide MNP-0

3 結(jié)論

利用分級(jí)透析將堿性蛋白酶水解制備澳洲堅(jiān)果多肽分離為8種不同分子量的多肽組分，其呈現(xiàn)不同的質(zhì)量占比，氨基酸組成與抑菌活性也有所不同。其中，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8質(zhì)量占比最高，其所含有的與抗菌作用有關(guān)的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸及總疏水性氨基酸占比也最高；不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽抑菌效果也不盡相同，其對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌抑菌活性較好，對(duì)白色念珠菌與黑曲霉相對(duì)較差。其中，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8對(duì)細(xì)菌類的金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌與真菌類的白色念珠菌、黑曲霉抑菌效果最好，其對(duì)受試細(xì)菌的抑菌活性優(yōu)于真菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，澳洲堅(jiān)果多肽MNP-8具有較好的抑菌活性，下一步可對(duì)其肽段進(jìn)行分離純化，評(píng)價(jià)生物活性，測(cè)定氨基酸序列，為澳洲堅(jiān)果功能肽的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。