郭博愷　李?！∪f科　李玉環(huán)　劉芳　叢銘　胡坤　岳大歷　葛永怡

摘要：進(jìn)行了以從患有冠癭病的葡萄樹根際土壤中分離獲得的1株黑曲霉Ⅺ用于抑制齊整小核菌的試驗(yàn)。其中超臨界萃取段、水提醇沉段以及正丁醇段表現(xiàn)出較好的抑制效果。抑制率分別達(dá)到了93.22%、74.11%、79.67%。被抑制的菌絲出現(xiàn)了膨大、畸形、原生質(zhì)聚集等現(xiàn)象，菌落大小也隨著平板含待測樣品的不同而不同。在測定電導(dǎo)率時(shí)，發(fā)現(xiàn)其隨著藥量濃度增高而增大，表明黑曲霉對齊整小核菌的細(xì)胞膜有較強(qiáng)的影響。另外還分別用DPPH法和ABTS法考察了黑曲霉不同極性分離產(chǎn)物的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；白絹病；生物防治；抗氧化

中圖分類號：S432.4⁺4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0290—05

黑曲霉（Aspergillus niger）是生物技術(shù)應(yīng)用中一種非常重要的微生物。早在1919年就被應(yīng)用于工業(yè)中用來發(fā)酵檸檬酸。除了檸檬酸，黑曲霉還是果膠酶、蛋白酶和淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶豐富的來源。此外，在過去的20年里，黑曲霉亦被用于生物轉(zhuǎn)化、濕法冶金和廢物處理。經(jīng)黑曲霉Asp-1#與蛇紋石尾礦作用后，可將部分尾礦中的鎂浸出而生成新物質(zhì)——有機(jī)酸鎂。另外在接種不同體積黑曲霉菌液的處理下，Cd、Zn等元素富集量均顯著低于空白對照處理。而黑曲霉作為一個(gè)安全的優(yōu)勢發(fā)酵菌種（GRAS），運(yùn)用在抗菌藥物研究與開發(fā)中的報(bào)道甚少，并且其抑制真菌病害的能力更是鮮有報(bào)道。而引起植物白絹病的齊整小核菌（Scleriti-um rolfsii）是一種在熱帶、亞熱帶地區(qū)普遍發(fā)生的植物病害病原，其寄主范圍廣，已知危害100多個(gè)科中的200多種植物，嚴(yán)重危害時(shí)，常造成作物大面積減產(chǎn)。所以本研究對黑曲霉抑制白絹病效果及機(jī)理進(jìn)行研究，著重考察黑曲霉不同極性分離段對其抑菌能力的強(qiáng)弱，以及對其細(xì)胞膜的影響，旨在補(bǔ)充真菌病害的生防菌種庫，另外還測試了黑曲霉不同極性分離段清除自由基的能力，為新型保鮮劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1菌株來源

黑曲霉（Aspergillus niger）XJ由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號：M206021。齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離并保藏。

1.2試劑

二苯代苦味?；杂苫―PPH，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；2，2′-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；二丁羥基甲苯（BHT，上海晶純生化科技股份有限公司）；Trolox（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；75%乙醇，95%乙醇；無水乙醇，過二硫酸鉀，正丁醇，乙酸乙酯，石油醚，葡萄糖均為分析純；瓊脂，代森錳鋅。

1.3儀器

DZG-6000電熱恒溫干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；JHT-C超凈工作臺（上?；巧锟萍加邢薰荆?；MLS-3750型獨(dú)立式高溫高壓滅菌鍋（北京諾匯誠科技有限公司）；HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱（江蘇省科學(xué)器材有限公司）；MGC-100P控溫光照培養(yǎng)箱（北京瑞爾欣德科技有限公司）；SKY-2112B雙層特大容量恒溫培養(yǎng)搖床（上海達(dá)平儀器有限公司）；CX31數(shù)碼生物顯微鏡（日本奧林巴斯）；UV757CRT紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；TopPette移液槍（大龍科技）；DDS-307電導(dǎo)率儀（上海智理科學(xué)儀器有限公司）；HAl20-40-0.5超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）。

1.4發(fā)酵液粗提物不同極性樣品溶液的制備

將200 g干燥菌絲體用700 mL 75%乙醇、60℃回流2 h，濾出乙醇并重復(fù)以上步驟1次，分別用500 mL乙醇、正丁醇、乙酸乙酯等幾種極性不同的有機(jī)溶劑分2次振蕩并依次萃取，對有機(jī)相及水相分別濃縮，得到不同代謝液粗提物樣品。

乙醇提取后取剩余殘?jiān)?，加水煮沸，微?.5 h，合并濾液，濾液于3 000 r/min離心20 min，取上清液于噴霧干燥箱濃縮，24 h后與95%乙醇混勻，靜置24 h后抽濾，即得水提醇沉萃取段樣品。

將200 g干燥菌絲體粉末混合均勻后，取50 g作為設(shè)備清洗之用，余下150 g分2次萃取完成。萃取壓力為5 MPa，溫度為50℃，以160～200 L/h流量得15 g超臨界萃取段樣品。

1.5不同極性分離段對白絹病菌的抑制作用及IC₅₀

含藥培養(yǎng)基制備：將不同分離段用DMSO配制成濃度為80 mg/mL的樣品，分別取150μL加入到15 mL已融化并冷卻至60℃左右的PDA培養(yǎng)皿中（直徑90 mm），使其充分混勻。以加入等體積DMSO的PDA平板為對照。

采用生長速率法，從PDA上培養(yǎng)7 d（待其長出菌核）的白絹病菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，菌絲面向下，接種于已經(jīng)凝固的含藥PDA培養(yǎng)基中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)光照培養(yǎng)。每個(gè)處理3次重復(fù)。分別于3、5、7 d后測量供試病菌在不同樣品的含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑，與對照比較計(jì)算各樣品處理對菌絲生長的抑制率。

由以上試驗(yàn)得到最優(yōu)的2個(gè)極性分離段，設(shè)置不同濃度梯度（0、5、15、30、45、60、75、80 mg/mL）進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)幾率值換算表，將抑制百分率換算成抑制概率值，計(jì)算其有效中濃度IC₅₀。

1.6不同極性樣品溶液對白絹病菌細(xì)胞膜的影響

采用電導(dǎo)法測定2個(gè)效果最優(yōu)極性分離段對病原菌細(xì)胞膜通透性的影響：在50 mL PDA培養(yǎng)液中接人1塊直徑為6 mm白絹病菌菌餅，于28℃下靜置培養(yǎng)7 d。加入效果最優(yōu)極性分離段至終濃度為0、5、15、30、45、60、75、80 mg/mL，于28℃下靜置培養(yǎng)。分別在0、1、2、3、4、5、6 h測定培養(yǎng)液中電導(dǎo)率。

1.7抗氧化能力的測定試驗(yàn)

采用DPPH方法，參照文獻(xiàn)[8]的方法并加以改良：取1 mL 0.1 mmol/L DPPH（乙醇為溶劑）、0.95 mL 0.05 mol/LTris-HCl緩沖液（pH值為7.4）、1 mL乙醇和50μL樣品混合30 min后在波長517 nm處常溫條件下測定吸光度，吸光度越小，其自由基清除劑的清除能力越強(qiáng)。計(jì)算公式為：

ABTS方法參照文獻(xiàn)[9]的方法并加以改良：將2.5 mL7 mmoL/L的ABTS和44μL 140 mmol/L的K₂S₂O₈溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜（12～16 h），得到ABTS+儲備液。將ABTS+儲備液用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液，20 mmol/L，pH值為7.4）稀釋，用分光光度計(jì)測量，使其在波長734 nm處吸光度為0.700±0.002，得到ABTS+工作液。取30μL不同濃度藥物與3.0 mL的ABTS+工作液混合，反應(yīng)6 min，常溫條件下于波長734 nm處測定吸光度。抗氧化能力強(qiáng)弱采用Trolox當(dāng)量（TEAC）來表示，即相同條件下測得的生物活性物質(zhì)的抗氧化活性與Trolox的抗氧化活性作對比，由此得到的比值來反映待測生物活性物質(zhì)的抗氧化能力。計(jì)算公式為：

2種方法計(jì)算得到的清除率后分別進(jìn)行作圖并計(jì)算其清除率的IC₅₀值。

2結(jié)果與分析

2.1不同極性分離段對白絹病菌的抑制作用

通過不同極性分離段的抑菌性試驗(yàn)后，得到3組效果最好的樣品作為梯度試驗(yàn)的依據(jù)（表1）。較之其他極性分離段，超臨界萃取段（圖1-H）、水提醇沉段（圖1-E）、正丁醇段（圖1-F）抑制率在處理7 d分別達(dá)到了93.22%、79.67%、74.11%。

黑曲霉XJ不同段粗提物對白絹病菌絲生長均有不同程度的抑制作用，菌絲在含藥培養(yǎng)基上生長緩慢，甚至在同一濃度下比陽性對照藥代森錳鋅（80 mg/mL）的抑制能力還要強(qiáng)很多（圖1-B）。正常狀態(tài)下菌絲無色透明，呈空心管狀結(jié)構(gòu)，有隔膜（圖2-A），呈放射狀生長，有分枝，在分枝的基部有明顯的縊縮，局部有鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象（圖2-D）。經(jīng)過水提醇沉萃取段和正丁醇段分別處理后，出現(xiàn)菌絲數(shù)量減少、直徑變粗、長度變短，出現(xiàn)褶皺、原生質(zhì)凝潔、嚴(yán)重變形等現(xiàn)象（圖2-B，圖2-C）。同時(shí)還觀察到有的菌絲呈念珠狀膨大（圖2-E）。

通過設(shè)置不同濃度（0、5、15、30、45、60、75、80 mg/mL）對3種待測藥品進(jìn)行濃度梯度試驗(yàn)（表2～表4），通過SPSS19.0軟件計(jì)算得到超臨界萃取段、水提醇沉萃取段和正丁醇段的半抑制濃度（IC₅₀）在處理后7 d分別為6.177、71.416、19.248 mg/mL。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在處理后3 d水提醇沉萃取段和正丁醇段在各濃度下均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力，而超臨界萃取段則在處理后7 d表現(xiàn)的抑菌能力最強(qiáng)。

2.2不同極性分離段對白絹病菌細(xì)胞膜的影響

超臨界萃取段、水提醇沉萃取段和正丁醇段對白絹病菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響見圖3至圖5。其中白絹病菌在空白對照的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率隨時(shí)間的延長表現(xiàn)十分穩(wěn)定。3種藥物處理后菌絲的電導(dǎo)率均在不同濃度下相較于空白對照有了顯著提高，且在處理3 h電導(dǎo)率達(dá)到頂峰，隨后呈下降趨勢。代森錳鋅處理在處理后2 h達(dá)到峰值，隨后穩(wěn)步下降。

2.3抗氧化能力的測定

表5表明，在2種方法中，水提醇沉萃取段、正丁醇萃取段和超臨界萃取段均有一定的清除DPPH和ABTS自由基的能力，但相對于陽性對照還相差甚遠(yuǎn)。水提醇沉萃取段在2種方法均體現(xiàn)了相對于正丁醇和超臨界萃取段更強(qiáng)的抗氧化能力。而超臨界萃取段在APTS法中的抗氧化能力遠(yuǎn)強(qiáng)于其在DPPH法中的表現(xiàn)。

按照試驗(yàn)方法，測得對水提醇沉萃取段、正丁醇萃取段和超臨界萃取段以及陽性對照品不同質(zhì)量濃度下抗氧化數(shù)據(jù)，并通過Excel 2010軟件對其制作出抗氧化質(zhì)量濃度對DPPH自由基和ABTS自由基影響的關(guān)系圖（圖6、圖7）。

圖6顯示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，水提醇沉萃取段對DPPH自由基的清除率均與質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度增加，對DPPH自由基的清除率也增大。當(dāng)質(zhì)量濃度低于45 mg/mL時(shí)，正丁醇萃取段和超臨界萃取段對DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，隨后繼續(xù)增加質(zhì)量濃度，清除率幾乎不變。當(dāng)質(zhì)量濃度低于5 mg/mL時(shí)，維生素C、Trolox和BHA對DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，隨后繼續(xù)增加質(zhì)量濃度，清除率幾乎不變。

圖7顯示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，水提醇沉萃取段、正丁醇萃取段和超臨界段萃取對ABTS自由基的清除率均同樣與質(zhì)量濃度呈正量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度增加，對ABTS自由基的清除率也增大。而水提醇沉萃取段在60 mg/mL前幾乎以線性條件增長，其后在80 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到了97.41%。

3討論

黑曲霉Ⅺ系從患有冠癭病的葡萄樹根際土壤中分離獲得的，與植物病原菌有相似的生態(tài)環(huán)境，生長快，且分泌抑菌物質(zhì)多。筆者所在課題組前期的研究表明其發(fā)酵液對根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和金黃色葡萄球菌（Staphylo-coccus aureus）有較強(qiáng)的抑制效果，本研究針對黑曲霉不同極性分離段對齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）的抑菌活性、細(xì)胞膜通透勝以及藥物自身抗氧化能力等幾個(gè)方面做了相關(guān)的研究，為進(jìn)一步完善其作用機(jī)制、明確其抑菌機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

在抑菌活性方面，通過顯微觀察，經(jīng)水提醇沉萃取段和正丁醇段處理后白絹病菌菌絲生長速率嚴(yán)重減緩，菌絲出現(xiàn)嚴(yán)重變形、細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)凝結(jié)和菌絲頂端膨大等現(xiàn)象。而且黑曲霉Ⅺ不同粗提物段也表達(dá)出了抑菌能力遠(yuǎn)強(qiáng)于化學(xué)農(nóng)藥的能力。

目前，報(bào)道的多是殼聚糖影響真菌細(xì)胞膜通透性增加以及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的外泄，但是關(guān)于黑曲霉對真菌細(xì)胞膜功能的影響還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)水提醇沉萃取段和正丁醇段處理白絹病菌絲在短時(shí)間內(nèi)即會(huì)使溶液電導(dǎo)率變化百分率明顯提高，并且在測定3 h時(shí)達(dá)到峰值，且不同濃度均高于對照中的電導(dǎo)率變化百分率。當(dāng)微生物處于不利環(huán)境或受到藥物毒害時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致其生物膜流動(dòng)性降低和半透性喪失，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)K⁺等電解質(zhì)大量外泄，而經(jīng)藥物處理后，培養(yǎng)液電導(dǎo)率的升高可以反映細(xì)胞膜滲透性的改變，抑制物破壞了細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞質(zhì)滲漏，電解質(zhì)不斷滲出，導(dǎo)致電導(dǎo)率的升高可能造成細(xì)胞流動(dòng)性降低，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性被破壞，從而導(dǎo)致原生質(zhì)外滲，破壞菌體細(xì)胞，從而起到抑菌作用。但由于未對胞內(nèi)蛋白和核酸等物質(zhì)測定，所以不能籠統(tǒng)地認(rèn)為其機(jī)制與殼聚糖完全相同。

食品如果受到微生物感染以及自由基的釋放會(huì)導(dǎo)致不飽和脂肪酸的自身氧化。而本研究發(fā)現(xiàn)的分離產(chǎn)物有與對照品相似的增強(qiáng)商品貨架期的長短及自由基清除能力，甚至還有抑制有害微生物的能力。針對于黑曲霉XJ 3個(gè)分離段的自由基清除能力，雖相對于對照品較弱，但黑曲霉作為一種對人體無害的優(yōu)勢發(fā)酵菌種，體現(xiàn)出的發(fā)酵能力強(qiáng)、抑菌譜廣的特性是對照品無法比擬的。另外在本研究中出現(xiàn)了其抑菌能力與抗氧化能力呈負(fù)增長關(guān)系，可以推測分離段對白絹病菌絲有氧化作用，以提高其抑菌能力。

綜上，本研究著重對黑曲霉粗提物對白絹病菌體外的抑菌效果、細(xì)胞通透性以及藥物自由基清除能力做了基本的試驗(yàn)，也部分揭示出了黑曲霉在這幾方面上的能力。但深入的研究還需在下一步的試驗(yàn)中予以實(shí)踐，例如黑曲霉是否導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的外泄，以及對抑制過后的菌體超微結(jié)構(gòu)下觀察等研究，這些對于完整闡述出黑曲霉的抑菌機(jī)制是十分必要的。