盧玉潤(rùn)，唐宇帆

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院,四川 成都 610072;2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院 四川大學(xué)華西第四醫(yī)院,四川 成都 610041)

目前，缺血性心臟病嚴(yán)重危害人類身體健康，其發(fā)病率日趨上升。氧氣是心肌細(xì)胞維持正常功能所必需的物質(zhì)。心臟依靠血液供應(yīng)氧氣，所以缺血引起缺氧時(shí)可造成心肌損傷、心臟功能下降等[1-2]。中藥肉桂是樟科植物的干燥樹(shù)皮，有補(bǔ)火益陽(yáng)，祛寒止痛，溫經(jīng)通血之功效，能暖脾胃，除積冷，通血脈，可治宮寒、腹痛、腰痛、胸痹等[3-4]。研究表明，肉桂醛可以改善高糖毒性對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的損傷，抑制心肌成纖維細(xì)胞凋亡[5]。肉桂通過(guò)改善心肌能量代謝減輕糖尿病大鼠心肌損傷[6]。低氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)在低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的介導(dǎo)作用。血管內(nèi)皮因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種促血管生長(zhǎng)的因子。HIF-1α可通過(guò)與VEGF啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia response element，HRE)結(jié)合激活VEGF基因的表達(dá)[7-8]。

本研究通過(guò)建立心肌細(xì)胞缺氧模型，分析不同劑量肉桂作用下，心肌細(xì)胞的增殖與凋亡情況；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)含量的變化；心肌損傷標(biāo)志蛋白肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激脢同工酶(Creatine kinase MB，CK-MB)、肌紅蛋白(Myoglobin,Myo)、HIF-1α、VEGF表達(dá)量的變化，探究肉桂對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自ATCC公司。

1.1.2 主要試劑與儀器：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco公司；青霉素、鏈霉素、總蛋白提取試劑盒和PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自吉諾生物制藥技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；SOD試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TBARS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abnova公司；山羊抗鼠cTnT、CK-MB、Myo、β-actin單抗以及HRP-Tag兔抗山羊購(gòu)自Cell Signaling公司；兔抗大鼠VEGF、HIF-1α單抗和辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔購(gòu)自上?？党缮锛夹g(shù)有限公司。儀器包括BIO-RAD酶標(biāo)儀(山東博科科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)IMARK)、奧斯巴林熒光顯微鏡(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號(hào)BX53)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉桂：購(gòu)自安國(guó)市弘發(fā)中藥飲片有限公司，批號(hào)160501。稱取肉桂0.5 g，加入5 ml的ddH2O，得100 mg/ml肉桂水煎液。

1.2.2 建模、分組及給藥：心肌細(xì)胞H9c2用含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]配制缺氧液：pH 6.8、37 ℃。用缺氧液替換DMEM培養(yǎng)液以模擬人體內(nèi)缺氧環(huán)境，在高濃度飽和N2(>95%，1 L/min)下作用30 min，在密閉缺氧培養(yǎng)箱(94%的N2，5%的CO2，O2≤1%)中孵育6 h，構(gòu)建慢性缺氧模型。

細(xì)胞隨機(jī)分成五組?？瞻讓?duì)照組：用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，不加肉桂水煎液處理；缺氧組：參照上述方法，構(gòu)建缺氧模型，不加肉桂水煎液處理；肉桂低劑量組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入終濃度為0.2 mg/ml的肉桂水煎液預(yù)處理細(xì)胞，然后做缺氧處理；肉桂中劑量組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入終濃度為1 mg/ml的肉桂水煎液預(yù)處理細(xì)胞，然后做缺氧處理；肉桂高劑量組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入終濃度為5 mg/ml的肉桂水煎液預(yù)處理細(xì)胞，然后做缺氧處理。各組細(xì)胞均在37 ℃孵育。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況：分別收集培養(yǎng)0、24、48、72 h的各組細(xì)胞，按試劑盒操作進(jìn)行，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的OD值。

1.2.4 一步法TUNEL試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞H9c2，接種于24孔板中的載玻片上(濃度為2×105個(gè)/L)，每孔500 μl，培養(yǎng)24 h后，按1.2.2 方法進(jìn)行藥劑和缺氧處理。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒方法進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡(×100倍)下觀察。隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)，取平均值表示凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)以凋亡細(xì)胞數(shù)與視野下細(xì)胞總數(shù)的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.2.5 SOD活性與MDA、TBARS含量測(cè)定：37 ℃孵育48 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按SOD、MDA和TBARS試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別于酶標(biāo)儀532、550、535 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.6 Western blot檢測(cè)cTnT、CK-MB、Myo、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)：37 ℃孵育48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，并用二喹啉甲酸法進(jìn)行定量。100 ℃加熱5 min至蛋白變性后，每組取蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜。封閉PVDF膜后，用1∶500倍稀釋的cTnT、CK-MB、Myo、β-actin、HIF-1α和VEGF抗體于4 ℃分別孵育膜24 h。洗滌后加入1∶5000倍稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況比較 與空白對(duì)照組比較，缺氧組的增殖活力降低、凋亡指數(shù)明顯升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與缺氧組比較，各劑量肉桂組的增殖活力以劑量依賴性的方式逐漸升高，而凋亡指數(shù)則逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況比較

2.2 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較，缺氧組細(xì)胞上清液SOD活性較低，MDA、TBARS含量較高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與缺氧組比較，各劑量肉桂組細(xì)胞上清液SOD活性以劑量依賴性逐級(jí)增加，而MDA和TBARS含量則逐漸降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 各組細(xì)胞心肌損傷標(biāo)志蛋白比較 Western blot檢測(cè)cTnT、CK-MB和Myo蛋白表達(dá)，缺氧組中各蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各劑量肉桂組與缺氧組比較，三種標(biāo)志蛋白表達(dá)量均以劑量依賴性逐級(jí)降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表3(圖1)。

表3 各組細(xì)胞心肌損傷標(biāo)志蛋白表達(dá)比較

圖1 各組細(xì)胞cTnT、CK-MB和Myo蛋白表達(dá)

2.4 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)比較 Western blot檢測(cè)各組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)，缺氧組中這兩種蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組高(均P<0.05)；各劑量肉桂組與缺氧組比較，HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)以劑量依賴性逐級(jí)增高(均P<0.05)。見(jiàn)表4(圖2)。

表4 各組細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)比較

圖2 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)

3 討 論

肉桂是一種具有強(qiáng)抗氧化活性的植物，在中醫(yī)學(xué)中常用于改善心臟功能。研究顯示在局部心肌缺血大鼠模型中，肉桂皮提取物對(duì)缺血性心律不齊和心臟損傷具有保護(hù)作用[10-12]。SOD、MDA、TBARS等氧化指標(biāo)常用來(lái)反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平[13-14]。SOD是一種生命體內(nèi)源抗氧化酶，可清除自由基[15-16]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，可加劇細(xì)胞膜的損傷[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)肉桂處理后能明顯提高心肌細(xì)胞SOD活性，降低MDA、TBARS含量。表明肉桂對(duì)缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基和減少脂質(zhì)代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。缺氧處理促使心肌損傷標(biāo)志蛋白cTnT、CK-MB和Myo的表達(dá)量顯著升高，而肉桂處理可以劑量依賴性的方式抑制這三種標(biāo)志蛋白表達(dá)量的升高[20-21]。說(shuō)明肉桂對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

HIF-1α在缺血性心肌病與心力衰竭中通過(guò)參與血管張力調(diào)節(jié)、血管生長(zhǎng)因子、葡萄糖攝取以及糖酵解等途徑調(diào)控氧的傳遞，增強(qiáng)缺氧組織的存活能力，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[22-24]。本研究結(jié)果顯示心肌缺氧細(xì)胞HIF-1α蛋白水平明顯提高，分析為缺氧處理初期心肌細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷通過(guò)自噬的HIF-1α/BNIP3途徑減輕心肌缺血再灌注損傷[25-26]。七氟醚通過(guò)Akt /HIF-1α/VEGF信號(hào)通路減輕心臟的氧化應(yīng)激，改善缺血再灌注引起的心肌損傷[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，肉桂可上調(diào)缺氧心肌細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平。據(jù)此推斷肉桂可能通過(guò)促進(jìn)HIF-1α及VEGF高表達(dá)來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血管新生，從而保護(hù)缺氧介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，肉桂對(duì)慢性缺氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活HIF-1介導(dǎo)的低氧反應(yīng)通路有關(guān)，初步揭示了肉桂的心臟保護(hù)作用機(jī)制，為肉桂治療缺血性心臟病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。