許璐璐，湯 宏，高 寧，沈 倩，陳 杰，吳海波

腦卒中是人類致殘及致死率較高的疾病之一，隨著中國(guó)社會(huì)老齡化、居民不健康生活，腦卒中的發(fā)生率每年增長(zhǎng)約8.3%，其中以缺血性卒中占比最多[1]。由于腦梗塞發(fā)生后出現(xiàn)急性局部血流中斷，從而發(fā)展為缺血缺氧、腦組織軟化壞死，甚至出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致昏迷和死亡[2]。隨著醫(yī)療環(huán)境及技術(shù)的發(fā)展，缺血性腦卒中治療已經(jīng)飛速發(fā)展，如阿司匹林等一系列抗血小板藥物的臨床應(yīng)用，以及近些年興起的溶栓取栓操作，均使缺血性腦卒中的治療有了明顯改善，但缺血性腦卒中引起的致殘率及帶給患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是無法估計(jì)的。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種能調(diào)節(jié)血管和神經(jīng)再生、組織重建及抗凋亡信號(hào)的細(xì)胞因子，HGF與其受體c-Met結(jié)合激活信號(hào)通路從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[3]。研究表明，HGF與激活的c-Met結(jié)合能保護(hù)心臟避免心肌缺血引起的損傷，以及有助于缺血后的心室重塑等[4]，HGF在Alzheimer疾病和脊髓軸索損傷中能起到神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]，但其在顱內(nèi)卒中的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)將探究大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型建立后HGF對(duì)腦組織凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠62只，每只重250～300 g，由美國(guó)羅馬琳達(dá)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為Sham組、MCAO組及HGF組，實(shí)驗(yàn)組按不同取材時(shí)間點(diǎn)分為模型后6、24、72 h。具體分組如下：實(shí)驗(yàn)1組：將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組(6、24、72 h)，每組6只大鼠，Western blot檢測(cè)取材使用的腦組織為大鼠受傷側(cè)/右側(cè)大腦半球腦組織；實(shí)驗(yàn)2組：將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組(24 h)，每組4只大鼠，用于免疫熒光共染定位c-Met與神經(jīng)元；實(shí)驗(yàn)3組：將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組(24 h)、HGF組，每組6只大鼠，在模型制作成功后24 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定，并處死大鼠，行TTC染色；實(shí)驗(yàn)4組：將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組(24 h)、HGF組，每組4只大鼠，用于TUNEL染色評(píng)估細(xì)胞死亡。

1.2 主要試劑及儀器重組人HGF(美國(guó)Abcam公司)，兔抗c-Met抗體(美國(guó)Aabcam公司)，德國(guó)徠卡熒光顯微鏡，TUNEL試劑盒(美國(guó)Roche公司)，TTC試劑(美國(guó)Sigma Aldrich公司)。

1.3 模型制作MCAO模型制作參照文獻(xiàn)[7]，氯胺酮(80 mg/kg)/甲苯噻嗪(20 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，仰臥位平躺暴露頸部，正中切開皮膚分離皮下組織及肌肉，顯露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，用顯微動(dòng)脈阻斷夾臨時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈血流，并在頸外動(dòng)脈近端剪一小口，將線栓經(jīng)小口逐步放入頸內(nèi)動(dòng)脈至右側(cè)大腦中動(dòng)脈處，感覺到阻力或線栓進(jìn)入長(zhǎng)度達(dá)1.8～2 cm即為達(dá)到大腦中動(dòng)脈處，此時(shí)結(jié)扎固定線栓，縫合皮膚，放置37 ℃溫箱復(fù)蘇。Sham組僅將線栓放入大腦中動(dòng)脈位置后立即拔出[8]。HGF組大鼠在MCAO造模成功后1 h經(jīng)鼻腔內(nèi)給藥，每只大鼠10 μg/kg。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分修定的Garcia評(píng)分和平衡木測(cè)試用于大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，Garcia評(píng)分共有6組(自發(fā)運(yùn)動(dòng)、四肢對(duì)稱性運(yùn)動(dòng)、前肢外伸、爬行、身體本體感覺及胡須觸覺反應(yīng))，每組評(píng)分范圍0～3分。平衡木為測(cè)試大鼠在狹長(zhǎng)的木棍上行走1 min的能力，評(píng)分范圍0～5分[9]。

1.5 梗塞面積評(píng)估模型制作成功后24 h處死大鼠，斷頭取腦，切片放入TTC中浸泡，待腦組織顏色改變后取出拍照，梗塞區(qū)面積使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)。

1.6 免疫熒光、TUNEL染色大鼠在模型制作成功后24 h再次麻醉大鼠，斷頭取腦，經(jīng)10%中性福爾馬林、30%蔗糖浸泡，冷凍切片機(jī)10 μm厚切片，分別經(jīng)過兔抗c-Met抗體過夜及相應(yīng)二抗，最后在熒光顯微鏡下拍照。TUNEL染色同樣取10 μm厚切片，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，最后在顯微鏡下拍照[10]。

1.7 Western blot法模型制作成功后在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)斷頭處死大鼠，取右側(cè)梗塞大腦半球腦組織快速放入液氮并轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱保存。待所有時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)備完成后按說明書操作提取蛋白，制備10%分離膠+4%積層膠，待電泳轉(zhuǎn)膜后，加入一抗孵育過夜，次日孵育二抗，再曝光顯影，曝光條帶使用Image J軟件分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組間數(shù)據(jù)分析采用Student-test或One-way ANOVA，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MCAO模型建立后腦組織中c-Met的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，大鼠MCAO模型建立后腦組織中c-Met表達(dá)逐漸增多，并在24 h達(dá)峰值，與Sham組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 MCAO模型建立后腦組織中c-Met的表達(dá)：與Sham組比較，*P<0.05

2.2 大鼠MCAO模型建立后24 h腦組織神經(jīng)元中c-Met的表達(dá)免疫熒光雙標(biāo)顯示，c-Met在大鼠腦組織神經(jīng)元中表達(dá)，且MCAO組的表達(dá)明顯多于Sham組(圖2)。

圖2 A.c-Met與神經(jīng)元標(biāo)志物(NeuN)定位：綠色為c-Met，紅色為NeuN，藍(lán)色為DAPI；B.從缺血半暗帶區(qū)域選取的圖片

2.3 HGF給藥對(duì)大鼠行為學(xué)評(píng)分和梗塞面積的影響HGF給藥組Garcia和平衡木評(píng)分較Sham組和MCAO組有明顯改善，差異有顯著性(P<0.05)，同時(shí)TTC染色顯示HGF組梗塞面積小于MCAO組，差異有顯著性(P<0.05，圖3)。

圖3 大鼠在MCAO模型后的行為學(xué)評(píng)分和TTC染色：A、B.分別是Modified Garcia和平衡評(píng)分;C、D.分別是大鼠腦組織TTC染色和梗塞面積統(tǒng)計(jì)；與Sham組比較，*P<0.05，與MCAO組比較，#P<0.05

2.4 HGF給藥對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL染色示，HGF給藥組TUNEL陽性細(xì)胞明顯少于MCAO組，差異有顯著性(P<0.05)，取材點(diǎn)為梗塞區(qū)附近的半暗帶(圖4)。

圖4 HGF給藥對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響：A.TUNEL與神經(jīng)元免疫熒光染色，紅色為TUNEL，綠色為神經(jīng)元，藍(lán)色為DAPI核；B.三組TUNEL陽性神經(jīng)元的百分比，與Sham組相比，*P<0.05；與MCAO組相比，#P<0.05；C.從缺血半暗帶區(qū)選取的圖片

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗塞后給予HGF治療能明顯減輕梗塞面積及提高大鼠行為學(xué)評(píng)分，而且能使TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞減少。首先實(shí)驗(yàn)通過大鼠MCAO模型建立后不同時(shí)間點(diǎn)確定HGF的受體c-Met在24 h達(dá)峰值。其次實(shí)驗(yàn)用免疫熒光法證明c-Met在大鼠腦組織神經(jīng)元中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)再次證明HGF給藥后大鼠的梗塞面積減少且行為學(xué)評(píng)分升高，可能是通過抗凋亡減輕TUNEL陽性細(xì)胞產(chǎn)生作用。

目前卒中是全球第二大主要致死疾病，僅次于缺血性心臟疾病。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年約有1 500萬人發(fā)生卒中[11]。缺血性卒中很大比例是由動(dòng)脈粥樣硬化所致，隨著知識(shí)的普及，人們逐漸認(rèn)識(shí)到高血壓、糖尿病、吸煙等均與缺血性卒中的發(fā)生密切相關(guān)[12]。目前對(duì)于缺血性卒中，全國(guó)各大醫(yī)院成立了卒中中心，爭(zhēng)取在發(fā)病6 h以內(nèi)進(jìn)行干預(yù)治療，挽救缺血壞死腦組織，然而對(duì)于中國(guó)這樣發(fā)展中國(guó)家，各個(gè)地域發(fā)展不均衡，尤其是偏遠(yuǎn)地區(qū)患者很難及時(shí)送診，因此積極探討藥物對(duì)卒中影響的研究有著至關(guān)重要的作用。

HGF是一種能調(diào)節(jié)血管再生、神經(jīng)再生、組織重建的細(xì)胞因子，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)HGF能通過AKT調(diào)節(jié)抗凋亡信號(hào)[13]。c-Met是一種絡(luò)氨酸激酶受體，其主要表達(dá)于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞以及神經(jīng)元[14]，HGF是c-Met的特異性配體，并且與c-Met結(jié)合后能導(dǎo)致一系列生物反應(yīng)，如增殖、遷移、血管再生等。Nakamura等[15]在對(duì)心臟的研究發(fā)現(xiàn)，缺血發(fā)生后使用HGF的特殊抗體使內(nèi)源性HGF失效，則導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡明顯升高，梗塞面積擴(kuò)大，從而證明HGF對(duì)缺血心臟有明顯保護(hù)作用。蔣晨雪等[16]在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met通路可通過PI3K/Akt促進(jìn)腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。然而HGF與c-Met結(jié)合在腦細(xì)胞產(chǎn)生作用的機(jī)制尚未明確。因此本實(shí)驗(yàn)從大鼠MCAO模型建立后腦組織神經(jīng)元中c-Met的表達(dá)，證明HGF/c-Met信號(hào)存在于神經(jīng)細(xì)胞中，并可能產(chǎn)生一系列的作用。

凋亡是缺血性腦卒中后常見的病理現(xiàn)象，腦組織的缺氧損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡，凋亡發(fā)生能直接影響缺血半暗帶區(qū)腦組織的存活，是腦梗進(jìn)一步加重的機(jī)制之一[17]。在心肌梗塞和腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met信號(hào)通路存在抗凋亡功能，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探究缺血性腦卒中后調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞能否改善半暗帶區(qū)腦組織的功能。Hong等[18]的研究證實(shí)內(nèi)源性HGF通過血液再通進(jìn)入腦組織產(chǎn)生抗凋亡功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c-Met在大鼠MCAO模型建立后表達(dá)升高，且在24 h達(dá)峰值，3天時(shí)表達(dá)仍偏高，說明大鼠在腦梗塞發(fā)生后腦組織可能出現(xiàn)自我保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)c-Met受體增多，在此時(shí)給予外源性HGF使之與c-Met結(jié)合，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)生物學(xué)反應(yīng)，調(diào)控凋亡細(xì)胞挽救缺血半暗帶區(qū)的腦組織，從而減輕大鼠腦組織梗塞面積，并改善大鼠的行為學(xué)評(píng)分。

卒中發(fā)生后腦組織會(huì)出現(xiàn)一系列的病理反應(yīng)過程，如氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡、血腦屏障的破壞及自噬的發(fā)生等，本文僅從凋亡角度探討HGF對(duì)腦組織缺血性卒中發(fā)生的作用，存在局限性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步探究HGF對(duì)其他作用的影響。綜上所述，HGF可以減輕大鼠腦梗塞后的凋亡，也許能成為研究治療梗塞的機(jī)制之一。