易子欣，易 婷，姚心雨，祝貝貝，賁亞琍，張 雯

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，湖北武漢 430000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌不足（1 型糖尿?。┗蛞葝u素抵抗（2 型糖尿?。┮鸬囊唤M代謝性疾病。糖尿病患者的高血糖環(huán)境，誘發(fā)結(jié)構(gòu)蛋白和基質(zhì)分子氧化產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），導(dǎo)致毛細(xì)血管病變[1-3]，引發(fā)多種并發(fā)癥。牙周病是涉及牙周支持組織的炎性和破壞性疾病，臨床特征包括牙齦炎癥、牙周附著喪失、牙周袋形成和牙槽骨吸收。研究表明糖尿病與慢性牙周炎之間有著雙向的密切關(guān)系[4]。糖尿病可以引發(fā)牙周組織氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致牙周組織的進(jìn)一步損傷以及牙槽骨的吸收[5-7]。微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro computed tomography，Mi?cro-CT）可準(zhǔn)確有效觀察骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)，其分辨率達(dá)到微米級(jí)別，能對(duì)小型樣本重建并呈現(xiàn)3D 影像，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行定性及定量分析[8]。本實(shí)驗(yàn)擬以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立1 型糖尿病大鼠模型，探討Micro-CT掃描技術(shù)用于觀測(cè)糖尿病大鼠牙槽骨微結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)選用健康雄性Sprague-Dawley 大鼠（5～ 6周齡，體重約200～225 g）8只，贛南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)入并通過(guò)動(dòng)物倫理審核。STZ 購(gòu)自德國(guó)Boeh?ringer Mannheim 公司；乙二胺四乙酸二鈉（10%EDTA），蘇木素染料，伊紅染料（購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司）；血糖試紙（購(gòu)自Miles Australia Pty.Ltd）；4%多聚甲醛（購(gòu)自中國(guó)上海生物工程有限公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和STZ（糖尿?。┙M（n=4），自由飲水和攝食，常規(guī)飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。STZ組大鼠腹腔內(nèi)注射55 mg/kg STZ[9]，對(duì)照組大鼠給予同等體積的0.1 M檸檬酸鹽緩沖液。72 h后大鼠空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L 的大鼠被視為糖尿病造模成功。繼續(xù)飼養(yǎng)12 周，并于第6 周和12 周檢測(cè)大鼠空腹血糖水平。

1.3 HE染色

處死大鼠，取上頜骨，經(jīng)生理鹽水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。保持組織細(xì)胞基本固有物質(zhì)，并使組織硬化。右側(cè)上頜骨于10%EDTA溶液脫鈣8 周。經(jīng)脫水、包埋制備石蠟切片。選擇包括完整的冠、根和牙周組織進(jìn)行切片（5 μm，中軸方向）。切片放入蘇木素染液中浸染5 min，流水沖洗返藍(lán)，再?zèng)_洗，后用酒精脫水，伊紅染液浸染5 min。400倍光學(xué)顯微鏡下拍攝大鼠上頜磨牙間牙齦乳頭部位照片，CaseViewer 2.0進(jìn)行分析，評(píng)估釉牙骨質(zhì)界（ce?mento-enamel junction，CEJ）牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的距離。

1.4 Micro-CT掃描成像分析

使用Micro-CT（SkyScan1176，Bruker，Kontich，比利時(shí)）掃描大鼠右側(cè)上頜骨樣本。掃描完成后，軟件CT analyser 手動(dòng)選擇興趣區(qū)間（Region of interest，ROI）：右側(cè)上頜第一磨牙根分叉區(qū)域。軟件Datev?iewer 對(duì)ROI 進(jìn)行三維重建，觀察牙槽骨吸收情況。軟件CT analyser對(duì)ROI區(qū)域的骨小梁結(jié)構(gòu)進(jìn)行參數(shù)測(cè)量，測(cè)量三次取平均值。主要測(cè)量參數(shù)包括骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁間距（trabec?ular separation，Tb.sp）。CT analyser 像素（pixel size）18 μm，最低灰度閾值（lower grey threshold）95，最高灰度閾值（upper grey threshold）255。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型大鼠的血糖值變化

STZ組大鼠腹腔注射STZ后，第6周和12周分別檢測(cè)血糖，STZ 組大鼠的空腹血糖水平均≥ 16.7 mmol/L，72 h后空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L，提示造模成功，見(jiàn)表1。正常對(duì)照組大鼠空腹血糖水平保持在5.0 mmol/L左右。

表1 STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的不同時(shí)間血糖值變化（mmol/L）

2.2 HE染色切片分析大鼠牙槽骨吸收程度

HE染色觀察大鼠上頜磨牙間牙槽嵴頂部位，可見(jiàn)正常對(duì)照大鼠牙槽骨邊緣光滑，牙周膜纖維排列整齊，見(jiàn)圖1A。STZ 組大鼠牙槽骨邊緣可見(jiàn)明顯吸收，牙周膜纖維排列紊亂，牙齦上皮有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1B。CaseViewer 2.0 軟件測(cè)量CEJ-ABC距離，結(jié)果顯示STZ 組相較正常對(duì)照組CEJ-ABC 距離明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.492，P <0.05），見(jiàn)圖1C。

圖1 大鼠上頜骨磨牙HE染色（×40）

2.3 Micro-CT分析牙槽骨微結(jié)構(gòu)

Micro-CT 掃描大鼠右側(cè)上頜骨樣本進(jìn)行重構(gòu)后，比較兩組牙槽骨吸收程度。可見(jiàn)較正常對(duì)照組，見(jiàn)圖2A，STZ組大鼠上頜骨磨牙矢狀正中面，有明顯牙槽骨吸收見(jiàn)圖2B。與對(duì)照組比較，STZ組骨小梁數(shù)目（Tb.N）明顯降低（t=4.610，P<0.05），見(jiàn)圖2C，骨小梁間距（Tb.sp）明顯升高（t=2.678，P<0.05），見(jiàn)圖2D。

圖2 大鼠右側(cè)上頜第一磨牙Micro-CT 分析

3 討論

牙周病是多因素疾病，牙周微生物觸發(fā)的炎癥反應(yīng)是牙周病的關(guān)鍵因素[10]。革蘭氏陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌是成人慢性牙周炎的重要病原體[11]，其主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），導(dǎo)致多種前炎癥介質(zhì)的釋放[12]，并通過(guò)活化破骨細(xì)胞及抑制成骨細(xì)胞的成骨功能，加重骨質(zhì)流失進(jìn)而引發(fā)牙槽骨的吸收[13]。另一方面，慢性牙周炎與糖尿病之間存在密切的雙向關(guān)系[14-16]。糖尿病引發(fā)的牙周高血糖環(huán)境，AGEs的形成，組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)，易可活化NF-κB信號(hào)途徑，導(dǎo)致大量前炎癥因子的釋放，誘發(fā)慢性炎癥[17]。高血糖環(huán)境導(dǎo)致的免疫-炎癥應(yīng)答紊亂，活化了機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，上調(diào)前炎癥介質(zhì)，進(jìn)而加重牙周破壞[18]。

本研究采用55 mg/kg STZ腹腔注射，72 h后大鼠的血糖水平≥16.7 mmol/L，血糖追蹤12 周，STZ 組大鼠的血糖水平均高于16.7 mmol/L，表明成功建立了糖尿病大鼠模型。鏈脲佐菌素STZ 是一種廣譜抗生素，具有抗菌、抗腫瘤的用途[19]，因其可被胰島β細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2 轉(zhuǎn)運(yùn)至β細(xì)胞內(nèi)，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰島β細(xì)胞具有特異性損傷，誘導(dǎo)產(chǎn)生1 型糖尿病[20]。對(duì)建模12 周后的STZ 組大鼠上頜骨進(jìn)行HE染色分析，可見(jiàn)STZ組大鼠牙齦呈明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨邊緣觀察到骨吸收陷窩，CEJ-ABC較對(duì)照組降低。Micro-CT分析顯示，STZ組骨小梁數(shù)量（Tb.N）下降，骨小梁間距（Tb.sp）較對(duì)照組顯著升高，掃描成像亦可見(jiàn)明顯的牙槽骨吸收。Micro-CT及HE染色結(jié)果一致，均呈現(xiàn)了STZ組大鼠牙槽骨吸收。以上結(jié)果證實(shí)，單純的血糖水平增高亦可導(dǎo)致大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周組織破壞。

研究分別采用Micro-CT和HE染色對(duì)糖尿病大鼠上頜骨模型進(jìn)行分析。相較于傳統(tǒng)的HE 染色方法，組織進(jìn)行Micro-CT前不需要脫鈣等繁瑣的標(biāo)本處理過(guò)程，對(duì)樣本損傷小。實(shí)驗(yàn)中Micro-CT 骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)選用了骨小梁數(shù)量Tb.N 和骨小梁間距Tb.Sp。Tb.N 通過(guò)計(jì)算單位長(zhǎng)度內(nèi)骨組織與非骨組織的交點(diǎn)數(shù)量評(píng)價(jià)每毫米內(nèi)的骨小梁數(shù)量；Tb.Sp 通過(guò)計(jì)算骨小梁之間髓腔的平均寬度評(píng)價(jià)骨小梁間隙。Tb.N和Tb.Sp，通過(guò)對(duì)松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以動(dòng)態(tài)的眼光定量分析STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠牙槽骨改變。顯然，Micro-CT能夠通過(guò)自身處理軟件重構(gòu)獲得骨內(nèi)部詳細(xì)的圖像，進(jìn)行精準(zhǔn)性定量分析，在骨微結(jié)構(gòu)分析方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。該方法作為一種準(zhǔn)確、快速、高分辨率的觀測(cè)方法，適用于大鼠牙槽骨分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)STZ 建立大鼠糖尿病模型，同時(shí)利用Micro-CT技術(shù)呈現(xiàn)牙周骨組織微結(jié)構(gòu)，獲得精確參數(shù)，為后續(xù)糖尿病牙槽骨的研究奠定基礎(chǔ)。