劉甜甜，楊舒涵，顏 梅，俸瑞璟，鄧 莉

（西南醫(yī)科大學：1臨床醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)；2口腔醫(yī)學院口腔醫(yī)學專業(yè)；3醫(yī)學基礎(chǔ)研究中心，四川瀘州 646000）

隨著生活水平的提高及受中國餐桌酒文化的影響，人們短期內(nèi)急性大量飲酒、醉酒的情況時有發(fā)生，這對肝細胞有明顯的毒害作用，易造成急性酒精性肝損傷，從而直接或間接導(dǎo)致酒精性肝病（alco?holic liver disease，ALD）的發(fā)生。ALD 早期常表現(xiàn)出脂肪肝等癥狀，若不及時加以控制，可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至導(dǎo)致肝功能衰竭；而在疾病的晚期，肝移植通常是唯一的解決辦法[1-2]。目前臨床上一般采取戒酒和給予藥物來進行綜合干預(yù)，但患者對戒酒的依從性較差，而許多相關(guān)的治療藥物毒副作用又較大[3]。故通過尋找解酒保肝成分來有效緩解酒精對肝臟的損害，早期控制對酒精性肝病具有重要意義。

檸檬含有豐富的檸檬烯、類黃酮化合物、維生素C、檸檬酸及多種微量元素，是一種營養(yǎng)和藥用價值都很高的水果，具有抗氧化、消炎、抗癌、抗腫瘤、殺菌等生理活性功能。有資料[4-8]表明檸檬中含有的檸檬烯、類黃酮化合物及維生素C 等成分都單獨對肝臟有一定保護作用，但是包含這些總成分的檸檬提取物對肝臟的作用效果如何卻未見相關(guān)報道。而水飛薊素是從水飛薊果中提取的一種活性素，有清除活性氧，對抗脂質(zhì)過氧化，促進肝細胞修復(fù)、再生等功能[9]，在臨床上常被用于治療慢性肝炎、肝硬化等疾病?？紤]到ALD 發(fā)病機制復(fù)雜，各個影響因素之間相互關(guān)聯(lián)，用單一藥物治療可能有一定局限性，猜想聯(lián)合用藥可能對ALD 有更好的療效。因此，本研究對檸檬提取物和水飛薊素單獨或聯(lián)合使用對急性酒精性肝損傷的干預(yù)效果進行觀察，擬為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 成年大鼠45 只（200 ± 20 g），由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供并通過動物倫理審核。

1.2 藥物及試劑

52度紅星二鍋頭（北京紅星釀酒股份有限公司，批號20180623）；檸檬提取物（西安派頓生物科技有限公司，產(chǎn)品規(guī)格10∶1）；水飛薊素膠囊（德國馬博士大藥廠，批號20180521）；谷草轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒（AST，批號20180605）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒(ALT，批號20180615)、超氧化物歧化酶檢測試劑盒(SOD，批號20180718)、丙二醛檢測試劑盒(MDA，批號20180713)，均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司，型號DZKW-4），紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司，型號UV752N）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，型號ELX808）。

1.4 動物分組與處理

造模參照王筱婧等[10]的模型及前期預(yù)實驗，將實驗動物隨機分成5 組：空白組、模型組、水飛薊素組、檸檬提取物組、聯(lián)合組（水飛薊素+檸檬提取物），每組9只。所有大鼠每日灌胃前禁食6 h，各組每天灌胃白酒或生理鹽水兩次（空白組每次按照0.5 mL/100 g 灌胃生理鹽水，其余各組每次按照0.5 mL/100 g灌胃52度紅星二鍋頭），兩次間隔1 h。白酒或生理鹽水灌胃后再間隔1 h，空白組和模型組按照1 mL/100 g 灌胃生理鹽水，水飛薊素組按照1 mL/100 g 灌胃水飛薊素（水飛薊素膠囊內(nèi)粉末狀藥品用蒸餾水按0.02 g/mL稀釋），檸檬提取物組按照1 mL/100 g灌胃檸檬提取物（采用0.5%吐溫80 溶液按照0.6 g/mL配制[11]），聯(lián)用組灌胃0.5 mL/100 g水飛薊素+0.5 mL/100 g檸檬提取物。一共灌胃8 d。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1檢測血清中ALT、AST含量

末次灌胃后禁食不禁水20 h（次日），用3%的戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，開胸，在大鼠心臟取血2 mL，血樣室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存。按照試劑盒說明書操作，用賴氏法檢測ALT、AST含量。

1.5.2計算肝臟系數(shù)及檢測MDA含量、SOD活力

將取出的肝臟用電子天平稱重，計算肝臟系數(shù)（計算公式：肝臟重量／體重×100%）。取肝左葉組織約0.5 g，剪碎，加入4.5 mL生理鹽水制備成10%的肝勻漿，2 000 r/min離心15 min，重復(fù)3次，留取上清液，-20 ℃保存。按照試劑盒說明書操作，用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.5.3制備病理切片

在肝右葉同一部位，取一塊肝組織，用4%多聚甲醛固定，將固定24 h后的肝組織進行石蠟包埋、切片（4 μm）、HE 染色處理。在光鏡下觀察肝組織細胞形態(tài)學變化，并觀察脂滴在肝臟分布的面積和范圍，對肝組織脂肪化進行評分。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)由SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法；單項有序的資料用等級秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中ALT、AST含量比較

如表1所示，與空白組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST 含量均明顯升高（P <0.05）。與模型組相比，水飛薊素組、檸檬提取物組和聯(lián)用組的大鼠血清中ALT、AST 含量均明顯的下降（P <0.01）。與單獨用檸檬提取物對大鼠進行干預(yù)相比，聯(lián)合組大鼠血清中ALT、AST含量下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 大鼠血清中ALT、AST含量的變化（）

表1 大鼠血清中ALT、AST含量的變化（）

注：a與模型組相比，P<0.05；b與聯(lián)用組相比，P<0.05

2.2 各組大鼠肝組織勻漿液中MDA 含量、SOD 活力比較

如表2所示，與空白組相比，模型組大鼠肝組織勻漿液中MDA 含量明顯升高（P <0.05），SOD 活力明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，水飛薊素組、聯(lián)用組大鼠肝組織勻漿液中MDA 含量降低（P <0.05）；聯(lián)用組大鼠肝組織勻漿液中SOD 活力升高（P<0.05）。與聯(lián)用組相比，水飛薊素組、檸檬提取物組大鼠肝組織勻漿液中MDA含量、SOD活力變化無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 大鼠肝組織勻漿液中MDA含量、SOD活力的變化（）

表2 大鼠肝組織勻漿液中MDA含量、SOD活力的變化（）

注：a與模型組相比，P<0.05。

2.3 各組大鼠肝臟系數(shù)比較

如表3所示，與空白組相比，模型組大鼠的肝臟重量未見顯著變化，而體重明顯下降（P<0.05），肝臟系數(shù)明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，水飛薊素組、檸檬提取物組和聯(lián)用組的動物體重增加（P<0.05），肝臟系數(shù)明顯下降（P<0.05），聯(lián)用組與兩個單獨干預(yù)組之間的肝臟系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠肝臟系數(shù)的變化（）

表3 各組大鼠肝臟系數(shù)的變化（）

注：a與模型組相比，P<0.05。

2.4 各組大鼠肝組織病理學變化情況

如圖1所示：空白組肝臟被膜完整，肝索排列整齊，門管區(qū)結(jié)構(gòu)未見明顯纖維組織增生，亦未見明顯炎性細胞浸潤。其余各組均出現(xiàn)不同程度的肝細胞空泡變性、脂肪變性，表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等和大小不等的微小空泡狀或細小顆粒狀物質(zhì)。對大鼠肝組織進行脂肪變性評級，標準參考文獻[12]。經(jīng)秩和檢驗分析結(jié)果如表4 所示，不同組間肝細胞脂肪變性程度有所不同，差異具有統(tǒng)計學意義（U=76.5，62.5，60，69；P=0.001，0.039，0.065，0.007）與空白組相比，模型組肝細胞脂肪變性程度加重。與模型組相比，水飛薊素組、聯(lián)用組肝細胞脂肪變性程度有所減輕；聯(lián)用組的肝細胞變性程度與兩個單獨干預(yù)組相比無差異。

表4 大鼠肝組織病理學變化

圖1 ↘肝細胞脂肪變性

3 討論

肝臟是人體酒精代謝的主要器官，但肝臟的代謝能力是有限的。一般而言，2周內(nèi)有暴飲史(乙醇量≥80 g/d)或超過5 年平均男性乙醇量≥40 g/d，女性乙醇量≥20 g/d（乙醇量（g）換算公式=飲酒量（mL）×乙醇含量（%）×0.8），即可造成酒精性肝損傷，增加酒精性肝病(ALD)發(fā)病風險[13]。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是存在于肝臟中的酶，在肝細胞受損及膜通透性增加的情況下，會從肝臟溢出到血清，且在血清中的含量與肝臟受損程度呈正比[14]，能很好反映肝細胞膜穩(wěn)定性[15]；肝組織病理切片能較直觀地觀察肝細胞變性壞死、肝索排列等情況，從而反映肝臟的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清AST、ALT水平升高，肝細胞發(fā)生脂肪變性，且指標變化都有統(tǒng)計學意義，提示急性酒精中毒模型建立成功。而相比于模型組，各干預(yù)組的AST、ALT含量都有顯著的下降，病理切片示肝細胞脂肪變性程度有所減輕，表明檸檬提取物和水飛薊素能穩(wěn)定肝細胞膜，減輕肝組織病變，緩解酒精對肝臟的損傷。

ALD 受多個相互關(guān)聯(lián)的因素影響，發(fā)病機制復(fù)雜，而氧化應(yīng)激及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化對疾病的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用[16]。機體活性氧簇主要是通過細胞色素P450-2E1(CYP2E1)誘導(dǎo)產(chǎn)生，在正常情況下，細胞內(nèi)存在活性氧清除劑，可以清除活性氧，保護細胞免受氧化損傷。但是大量飲酒導(dǎo)致CYP2E1活性增強，使活性氧產(chǎn)生增加，抗氧化物質(zhì)被大量消耗，體內(nèi)的氧化-抗氧化機制失去平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)等分子的氧化損傷，從而影響細胞呼吸功能及ATP 生成，導(dǎo)致肝細胞壞死或凋亡[17-18]。而過量的氧自由基也會導(dǎo)致線粒體及肝細胞等部位的生物膜脂質(zhì)過氧化，從而誘導(dǎo)炎細胞浸潤，激活Kupffer細胞和肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，促使肝臟纖維化的發(fā)生[19]；還會破壞膜結(jié)構(gòu)和通透性，影響其功能，如線粒體受損會使肝細胞對脂肪酸的分解功能降低，引起肝細胞脂肪堆積[20]。超氧化物歧化酶(SOD)是活性氧清除劑，其活力高低可以反映機體清除氧自由基的能力；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可衡量肝臟脂質(zhì)過氧化程度。在本次實驗結(jié)果中，對比空白組，模型組大鼠的肝臟MDA 水平升高、SOD 活性下降，進一步提示實驗造模成功。用檸檬提取物進行干預(yù)后，檸檬提取物組大鼠的MDA 含量降低、SOD 活性增加，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。而聯(lián)用水飛薊素時，聯(lián)用組的MDA水平降低、SOD活性升高（P<0.05），提示單獨應(yīng)用檸檬提取物對肝臟的保護作用較弱，而檸檬提取物和水飛薊素聯(lián)合應(yīng)用在減少酒精對人體的影響、保護肝臟方面有一定的協(xié)同作用，其機制可能與增強氧自由基的清除，抑制超氧陰離子毒性，減輕氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

肝臟系數(shù)是毒理實驗常用指標，其值的變化可以粗略反映肝臟的病變類型，如系數(shù)增大表明肝臟可能脂肪變性或增生肥大，反之則表明肝臟萎縮或其他退行性改變[21]。與模型組相比，模型組的肝臟系數(shù)值雖比干預(yù)組大（P<0.01），但分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：干預(yù)組與模型組間的大鼠肝臟重量差異無統(tǒng)計學意義，肝臟系數(shù)有顯著差異是由體重變化導(dǎo)致的。推測此現(xiàn)象是因為酒精影響大鼠的食欲或消化吸收，使大鼠體重明顯下降，且此次實驗周期短，實驗可能在肝臟重量沒有下降或下降趨勢不明顯時已結(jié)束，故肝臟重量差異無統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)論

單獨應(yīng)用檸檬提取物對肝臟的保護作用較弱，而聯(lián)合應(yīng)用檸檬提取物和水飛薊素對保護肝臟有一定的協(xié)同作用，在穩(wěn)定肝細胞膜、減輕肝細胞脂肪變性等方面有一定價值。本實驗有助于相關(guān)制劑臨床價值的挖掘，為ALD 的早期防治提供了一個新思路，但具體機制還有待于進一步深入研究。