秦 凱，程 熠，黃露露，袁響林

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢430030）

我國癌癥中心最新報告指出［1］，宮頸癌位居中國惡性腫瘤發(fā)病率的第八位，且在女性惡性腫瘤中的發(fā)病率（2.83%）僅次于乳腺癌，位居第二。盡管早期篩查、手術(shù)治療、放化療、靶向治療等均被證實可有效降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，但是迄今為止，該病的5年生存率為67.6%，仍未達(dá)到理想目標(biāo)，尤其是晚期患者，5年無疾病生存率僅為50%［2］，因此，尋找治療宮頸癌的新靶點尤為重要。

近年來，腫瘤與免疫的相關(guān)性研究呈爆發(fā)式進(jìn)展，目前國內(nèi)外較為公認(rèn)的“免疫逃逸”學(xué)說成為腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制之一，基于該機(jī)制而采取的程序性死亡受體1/程序性死亡受體?配體1（PD?1/PD?L 1）免疫療法成為人類惡性腫瘤治療史上的一次革命。研究證實［3］，約95%的宮頸癌患者可能由持續(xù)感染人乳頭瘤病毒所引起，而人體免疫系統(tǒng)在感染應(yīng)答過程中扮演重要角色，為該病的免疫治療奠定了基礎(chǔ)；還有研究顯示［4］，約80%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者存在PD?L 1高表達(dá)的情況，這使得宮頸癌成為PD?1/PD?L 1免疫療法的主要候選疾病之一。但是在KEYNOTE?158（NCT 02628067）研究中［5］，帕博麗珠單抗應(yīng)用于晚期宮頸癌患者的總體客觀緩解率（ORR）僅為12.2%，其中PD?L 1陽性者ORR為14.6%，而PD?L 1陰性者免疫治療均無效。因此，篩選宮頸癌免疫治療的獲益人群是提高ORR和改善預(yù)后的有效措施之一。腫瘤中發(fā)生浸潤的免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其浸潤模式與臨床結(jié)果存在一定相關(guān)性，并可能成為藥物靶標(biāo)來提高生存率，因此，分析宮頸癌浸潤性免疫細(xì)胞的組成特點，以及浸潤模式與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，有利于臨床篩選宮頸癌免疫治療的獲益人群。本研究應(yīng)用Cibersort軟件對公共數(shù)據(jù)庫癌癥基因組圖譜（TCGA數(shù)據(jù)庫）中宮頸癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步提高宮頸癌的生存率奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從公共數(shù)據(jù)庫癌癥基因組圖譜（the cancer ge?nome atlas，TCGA，https：//cancergenome.nih.gov/）中下載所有宮頸癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)共309例，其中包含宮頸癌組織306例、正常宮頸組織3例，并下載相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、臨床分期、腫瘤分級和生存狀態(tài)等。

1.2 數(shù)據(jù)處理方法

1.2.1 計算宮頸鱗狀細(xì)胞癌中浸潤性免疫細(xì)胞的組成 安裝perl軟件并將基因表達(dá)數(shù)據(jù)整理成行名為基因名、列名為樣品名的矩陣，提取獲得宮頸癌組織和正常組織轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用R語言limma包、BiocManager包將表達(dá)譜矩陣校正，用Cibersort軟 件（http：//cibersort.stanford.edu/）來計算每個腫瘤組織中M 1巨噬細(xì)胞、M 2巨噬細(xì)胞、M 0巨噬細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等共22種浸潤性免疫細(xì)胞類型的相對比例。為進(jìn)一步提高精度，以Cibersort軟件中P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本篩選，篩選出有意義的樣本后，利用R語言及相應(yīng)包繪制樣本中每種免疫細(xì)胞的柱狀圖（即宮頸癌及正常樣本中各種免疫細(xì)胞占比）、相關(guān)性熱圖（即宮頸癌組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比的相關(guān)性）和小提琴圖（即可視化免疫細(xì)胞在宮頸癌及正常組織中的分布）。

1.2.2 評估宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性 將上述轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，評估宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征（年齡、臨床分期、腫瘤分級）的預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用R語言（3.6.1版本）和Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對于丟失的數(shù)據(jù)，則應(yīng)用列表刪除法進(jìn)行處理，如果缺少任一單個值，則將該樣本整體排除。以R語言中的corrplot包繪圖進(jìn)行不同免疫細(xì)胞間相關(guān)性的檢測；采用Perl分析宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征的相關(guān)性；再根據(jù)免疫細(xì)胞水平中位值將患者分為高、低浸潤組，應(yīng)用R語言中的survival包，通過K?M Log?Rank法計算其與生存的相關(guān)性，并繪制圖形。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌樣本的臨床病理特征

307例宮頸癌樣本中，年齡>50歲119例（38.8%），≤50歲188例（61.2%）；臨床分期為T 1者141例（46.0%），T 2者72例（23.4%），T 3者21例（6.8%），T 4者10例（3.3%），未知63例（20.5%）；腫瘤分級為G1者18例（5.9%），G2者136例（44.3%），G3者120例（39.1%），G4者1例（0.3%），GX者24例（7.8%），未知8例（2.6%）；生存狀態(tài)為存活237例（77.2%），死亡70例（22.8%）。

2.2 宮頸癌組織浸潤免疫細(xì)胞情況

采用Cibersort評估了306例宮頸癌和3例正常組織免疫細(xì)胞的分布情況，利用R語言及相應(yīng)包繪制的柱狀圖、相關(guān)性熱圖和小提琴圖分別如圖1～3所示。

圖1 宮頸癌及正常樣本中各種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖Fig 1 Histogram of the proportion of 22 immune cells in all samples

圖2 宮頸癌組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比相關(guān)熱圖Fig 2 Correlation heatmap of the proportion of each immune cell in cervical cancer samples

圖1和圖3顯示，宮頸癌腫瘤組織與正常組織相比，靜息狀態(tài)樹突細(xì)胞、活化的樹突細(xì)胞、M 1巨噬細(xì)胞及活化的CD4+記憶性T細(xì)胞含量較高；M 2巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及活化的肥大細(xì)胞含量較低。圖2顯示，在宮頸癌組織中，構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括：M 0巨噬細(xì)胞與活化的肥大細(xì)胞（0.54），活化的肥大細(xì)胞與靜息狀態(tài)樹突細(xì)胞（0.60）；靜息狀態(tài)樹突細(xì)胞與活化的樹突狀細(xì)胞（?0.55）。

圖3 宮頸癌及正常組織中免疫細(xì)胞構(gòu)成比小提琴圖（藍(lán)色：正常組織；紅色：子宮頸癌）Fig 3 Violin plots of immune cells in cervical cancer and nor mal tissues（Blue：normal tissues；Red：cervial cancer tissues）

2.3 宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征的相關(guān)性

2.3.1 與年齡的相關(guān)性 根據(jù)年齡是否大于50歲進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，M 1巨噬細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞的含量與患者年齡呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；濾泡輔助性T細(xì)胞、活化和未活化的自然殺傷（NK）細(xì)胞和幼稚CD4+T細(xì)胞的含量與患者年齡呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 宮頸癌各免疫細(xì)胞含量與年齡的相關(guān)性Fig 4 The correlation between the content of immune cells in cervical cancer and age

2.3.2 與臨床分期和腫瘤分級的相關(guān)性 根據(jù)臨床分期和腫瘤分級進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，各免疫細(xì)胞含量與臨床分期和腫瘤分級之間，均無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

2.4 宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤模式與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)各免疫細(xì)胞構(gòu)成比中位值高低，采用K?M Log?Rank法計算其與生存的相關(guān)性，結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞構(gòu)成水平對患者生存有明顯影響（P<0.05），其中，靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期短，而濾泡輔助性T細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期長，見圖5。

圖5 免疫細(xì)胞構(gòu)成水平的K?M生存曲線Fig 5 K?M sur vival curve of the level of immune cell composition

3 討論

既往大多用免疫組化法或流式細(xì)胞術(shù)來分析腫瘤組織免疫細(xì)胞的浸潤模式，程序繁瑣、回饋效率低，本研究采用的Cibersort軟件由斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員Newman等于2015年發(fā)明，該軟件采用了反卷積算法，可準(zhǔn)確、快速地分析復(fù)雜組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，優(yōu)勢明顯［6］。本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，對宮頸癌浸潤性免疫細(xì)胞的組成特點進(jìn)行了統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與正常組織相比，宮頸癌腫瘤組織中，靜息狀態(tài)樹突細(xì)胞、活化的樹突細(xì)胞、M 1巨噬細(xì)胞及活化的CD4+記憶性T細(xì)胞含量較高，而M 2巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及活化的肥大細(xì)胞含量較低，且有3對免疫細(xì)胞之間的構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大，說明這些免疫細(xì)胞參與了宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，且與其他惡性腫瘤相似，宮頸癌組織中免疫細(xì)胞的組成存在一定的特異性，可為該病的早期篩查與診斷提供參考。

進(jìn)一步對宮頸癌組織中免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，M 1巨噬細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞和γδT細(xì)胞的含量與患者年齡呈正相關(guān)，濾泡輔助性T細(xì)胞、活化和未活化的NK細(xì)胞和幼稚CD4+T細(xì)胞的含量與患者年齡呈負(fù)相關(guān)，但是各免疫細(xì)胞含量與臨床分期和腫瘤分級之間均無顯著相關(guān)性，這一結(jié)果預(yù)示，免疫細(xì)胞浸潤模式檢測并不能用于判斷宮頸癌的臨床分期和腫瘤分級，而年齡可能是影響組織免疫細(xì)胞浸潤模式的重要因素之一。隨著年齡的增長，腫瘤在不斷進(jìn)展的過程中，免疫細(xì)胞浸潤模式在發(fā)生著轉(zhuǎn)變。依據(jù)功能的不同，巨噬細(xì)胞可分為M 1巨噬細(xì)胞和M 2巨噬細(xì)胞兩種類型，前者由M 0巨噬細(xì)胞受干擾素（IFN）?γ刺激活化形成，主要參與炎癥反應(yīng)及抗腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答過程，具有顯著的抗腫瘤生成作用，后者則具有激活腫瘤細(xì)胞增殖的作用，可促進(jìn)腫瘤生長［7］。本研究中M 1巨噬細(xì)胞與患者年齡呈正相關(guān)，說明隨著年齡的增長，體內(nèi)M 1巨噬細(xì)胞大量增殖，以發(fā)揮抗腫瘤進(jìn)展的作用。其次是CD4+記憶性T細(xì)胞。有研究證實［8］，活化的CD4+記憶性T細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)IFN?γ、腫瘤壞死因子?α和白介素?2等的合成與釋放來控制宮頸癌腫瘤細(xì)胞的增殖，因此高水平的活化CD4+記憶性T細(xì)胞與較高的生存率相關(guān)，說明該類型細(xì)胞的浸潤通?？深A(yù)示腫瘤的良好預(yù)后，而未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞由于受到嚴(yán)格的調(diào)控而幾乎不能表達(dá)與IFN?γ、腫瘤壞死因子?α和白介素?2等合成與釋放相關(guān)的基因，可能與較差的預(yù)后相關(guān)。最后是γδT細(xì)胞可產(chǎn)生IFN?γ和腫瘤壞死因子?α等抗腫瘤因子，從而發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用，有利于預(yù)后改善［9］，本研究中γδT細(xì)胞含量與年齡呈正相關(guān)，說明年齡越大，患者體內(nèi)的γδT細(xì)胞增殖越快，以達(dá)到控制宮頸癌進(jìn)展的目的。

最后對宮頸癌組織中免疫細(xì)胞浸潤模式與預(yù)后的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期短，而濾泡輔助性T細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期長，說明這兩種免疫細(xì)胞在宮頸癌的預(yù)后預(yù)測中具有一定應(yīng)用價值。其中，濾泡輔助性T細(xì)胞在機(jī)體免疫反應(yīng)過程中起到關(guān)鍵作用，其分化過程由多種因子參與［10］。國內(nèi)外學(xué)者已證實該細(xì)胞可作為多種惡性腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在卵巢癌患者中，含T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3（TIM?3）主要在Pd?1陽性的濾泡輔助T細(xì)胞中表達(dá)，而TIM?3在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中的含量明顯高于外周血，具有誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IgM、IgG和IgA的功能，從而調(diào)節(jié)腫瘤免疫［11］。歐陽燕等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，高水平的濾泡輔助性T細(xì)胞與胃癌患者較長的總生存時間相關(guān)。還有一項研究對乳腺癌患者進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，濾泡輔助性T細(xì)胞在腫瘤組織中的基因印跡與生存期呈正相關(guān)［13］。本研究中，濾泡輔助性T細(xì)胞含量與患者年齡呈負(fù)相關(guān)，而且泡輔助性T細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期長，說明該細(xì)胞可作為宮頸癌的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。樹突狀細(xì)胞是人類免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的特異性抗原提呈細(xì)胞，能夠激活腫瘤免疫治療中的T細(xì)胞。de Azevedo?Santos等［14］發(fā)現(xiàn)自乳腺癌患者和健康供者的樹突狀細(xì)胞的表面表型、細(xì)胞因子分泌模式和淋巴細(xì)胞刺激活性存在明顯差異。但是目前，靜息狀樹突細(xì)胞在腫瘤中的作用研究相對較少，需進(jìn)一步通過臨床研究加以證實。

綜上所述，通過Cibersort軟件對宮頸癌浸潤免疫細(xì)胞組成進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可為免疫細(xì)胞與宮頸癌的相關(guān)性研究提供新的線索和依據(jù)：免疫細(xì)胞參與了宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，且與正常組織相比，宮頸癌組織中免疫細(xì)胞的組成存在一定的特異性，可為該病的早期篩查與診斷提供參考；不同年齡段患者可能存在不同的免疫細(xì)胞浸潤模式，臨床可以此為基礎(chǔ)，探索藥物靶標(biāo)，并進(jìn)行有針對性地治療來提高生存率；靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞在宮頸癌的預(yù)后預(yù)測中具有一定應(yīng)用價值，可作為宮頸癌臨床免疫治療可能的療效預(yù)測指標(biāo)。