徐冬川，何蟬伊，林 琦，丁毅鵬

（海南省人民醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院1.急診科，2.全科醫(yī)學(xué)科，海南 海口570311）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其主要特征是持續(xù)呼吸流量有限，肺功能不可逆［1］。有數(shù)據(jù)顯示，2020年慢性阻塞性肺疾病已成為全球第四大死亡原因［2］。研究表明，有20%的吸煙者會(huì)發(fā)展成COPD患者，而終身吸煙者50%是COPD患者［3］。外 泌體（exosomes）是指囊泡結(jié)構(gòu)中，含有RNA或者蛋白的具膜小泡，直徑一般在40～100 nm［4］。外泌體通過(guò)其攜帶的信使RNA（mRNA），miRNA和蛋白質(zhì)等作用于受體細(xì)胞，從而影響受體細(xì)胞的增殖與遷移［5，6］。大量研究證實(shí)，目前已發(fā)現(xiàn)多種外泌體的miRNA參與COPD的發(fā)生與發(fā)展［7，8］。本研究探討香煙提取物（cigarette smoke ex?tract，CSE）對(duì)支氣管上皮細(xì)胞16HBE外泌體miR?186表達(dá)量的影響，以及16HBE來(lái)源的外泌體miR?186對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人支氣管樣上皮細(xì)胞16HBE和人胚成纖維細(xì)胞MRC?5購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清（FBS），MEM和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。miR?186引 物、miR?186 mimic和 陰 性 載 體（NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。CCK?8試劑盒購(gòu)于武漢華美公司。Bcl2L 11、GAPDH一抗和二抗購(gòu)于Thermo公司。使用美國(guó)FEI透射電子顯微鏡進(jìn)行外泌體拍照。雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 CSE的制備

20支市售黃金葉牌香煙完全燃燒產(chǎn)生的煙霧，充分混合溶于20 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，之后使用0.22μm濾膜過(guò)濾，得到含CSE的DMEM母液［9］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與CSE處理 16HBE和MRC?5細(xì)胞分別使用含10%FBS的DMED和MEM培養(yǎng)基，置于含有5%CO2以及溫度37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。16HBE細(xì)胞使用終濃度為20%的CSE刺激16HBE細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞上清，采用超離的方式分離細(xì)胞上清外泌體。將從16HBE細(xì)胞收集的外泌體按CES處理后外泌體與溶劑對(duì)照外泌體分為CES?exo組及CON?exo組，每組3個(gè)重復(fù)處理MRC?5細(xì)胞。

1.3.2 外泌體分離 將收集的16HBE細(xì)胞上清在4℃以21 000g離心15 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新試管中。加入1/4體積的ExoQuick Solution（美國(guó)System Biosciences），上下混合后于4℃孵育2 h。1 500g離心混合物30 min，棄去上清液。再次1 500g離心5 min再次棄去上清液。加入PBS重懸外泌體。

1.3.3 透射電子顯微鏡（TEM） 將外泌體與等體積的4%多聚甲醛混合，轉(zhuǎn)移10μL樣品到聚乙烯醇縮甲醛/碳涂層的鎳格柵上，室溫下將膜吸附20 min。用100μL的PBS快速洗滌后，50μL 1%的戊二醛固定5 min，蒸餾水洗滌7次。之后用4%乙酸鈾酰溶液浸泡樣本5 min，冰上加入4%乙酸鈾酰2%甲基纖維素（1∶9）溶液的混合物中孵育10 min。用濾紙吸干并自然風(fēng)干，使用透射電子顯微鏡（日本JEOL，#JEM?2100）進(jìn)行觀察并進(jìn)行拍照［10］。

1.3.4 外泌體RNA提取與qPCR檢測(cè) CES?exo組與CON?exo組處理后，使用外泌體RNA純化試劑盒（美國(guó)System Biosciences）從外泌體中提取總RNA。用Bioanalyzer 2100儀器（美國(guó)安捷倫）評(píng)估分離的RNA濃度及其完整性。miDETECT A TrackTM miRNA qRT?PCR試劑盒包含miR?186與U 6特異的正向引物和與poly（T）接頭互補(bǔ)的序列作為反向引物（中國(guó)銳博）。細(xì)胞上清中總外泌體RNA進(jìn)行聚腺苷酸化，使用poly（T）銜接子逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使 用RT?PCR試劑盒（TaKaRa）和CFX96 PCR系統(tǒng)（美國(guó)Bio?Rad）檢測(cè)miR?186表達(dá)。以U 6基因?yàn)閮?nèi)參，采用2?ΔΔct法比較CSE處理組和正常對(duì)照組表達(dá)差異。

1.3.5 CCK?8檢測(cè)MRC?5細(xì)胞增殖 CES?exo組與CON?exo組處理后，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MRC?5細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)的第1天開(kāi)始，連續(xù)5 d分別向每孔加入10μL的CCK?8溶液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度（OD）值，以O(shè)D450值代表細(xì)胞增殖水平。

1.3.6 雙熒光素酶驗(yàn)證miR?186與Bcl2L 11靶向結(jié)合 將miR?186與Bcl2L 11結(jié)合部位的野生型（WT）與突變型（MUT）序列分別插入到螢火蟲(chóng)熒光素酶基因下游構(gòu)建表達(dá)載體。將miR?186 mimics與pmirGLO?Bcl2L 11?WT和MUT重組質(zhì)粒，以及對(duì)照組miRNA?NC與Bcl2L 11的WT和MUT重組質(zhì)粒與Lipo?2000脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，采用酶標(biāo)儀（BIO?RAD公司）檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.7 Western blot檢測(cè) 使用細(xì)胞裂解液提取每組細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)濃度由BCA試劑盒測(cè)定，加5×Loading buffer在100℃金屬浴15 min變性。上樣時(shí)，計(jì)算使每組蛋白上樣量為20μg蛋白，進(jìn)行SDS?PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶1 000），4℃過(guò)夜，洗膜6次，每次5 min，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000），溫室1 h。洗膜3次后，每次5 min。添加化學(xué)發(fā)光以顯示蛋白，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照蛋白條帶，使用Image J分析蛋白條帶灰度表達(dá)，以GAPDH為相對(duì)內(nèi)部參考得到蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism6軟件用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，兩組之間采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離16HBE外泌體的特征

透射電鏡檢測(cè)16HBE細(xì)胞上清外泌體發(fā)現(xiàn)，16HBE細(xì)胞分泌的外泌體呈現(xiàn)出直徑約100 nm的球形囊泡結(jié)構(gòu)，符合外泌體特征，見(jiàn)圖1。因此本研究分離外泌體方法可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 透射電鏡鑒定16HBE細(xì)胞外泌體囊泡結(jié)構(gòu)（加速電壓：100 kV；放大倍率：15 000×）Fig 1 Identifiation of the vesicle structur e of 16HBE cells exosomes using transmission electron mi?croscopy（Acceleration voltage：100 k V；Magni?fication：15 000×）

2.2 CSE明顯促進(jìn)16HBE分泌外泌體miR?186

通過(guò)qRT?PCR檢測(cè)CSE處理支氣管上皮細(xì)胞與未處理對(duì)照細(xì)胞的上清外泌體miR?186的相對(duì)表達(dá) 豐 度，CSE?exo組 中miR?186相 對(duì) 表 達(dá) 水 平（3.103±0.405）明 顯 高 于CON?exo組（1.050±0.011）（t=5.070，P<0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組16HBE細(xì)胞上清外泌體miR?186相對(duì)表達(dá)量Fig 2 Expression of exosome miR?186 in supernatant of CSE?treated 16HBE cells and control group

2.3 CSE誘導(dǎo)16HBE外泌體miR?186促進(jìn)MRC?5增殖

為確定CSE處理16HBE來(lái)源的外泌體miR?186對(duì)COPD患者成纖維細(xì)胞的影響，筆者使用從CSE處理的16HBE細(xì)胞上清中分離的外泌體miR?186（CSE?exo）培養(yǎng)MRC?5細(xì)胞，使用CCK?8法檢測(cè)MRC?5細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，第5天CSE?exo組MRC?5細(xì) 胞 的OD450相 對(duì) 變 化（OD450/fold）倍 數(shù)（7.217±0.101）明 顯 高 于CON?exo組（4.915±0.117）（t=14.90，P<0.001），見(jiàn)圖3；表明CES?exo組外泌體促進(jìn)MRC?5細(xì)胞增殖。

圖3 兩組OD450相對(duì)變化（OD450/fold）倍數(shù)Fig 3 Comparison of OD450/fold between the two groups

2.4 miR?186對(duì)Bcl2L 11的調(diào)控作用

通過(guò)Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR?186與Bcl2L 11結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖4A，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bcl2L 11+miR?186組相對(duì)熒光活性（0.683±0.045）明 顯 低 于BCL 2L 11+miRNA?NC組（1.057±0.061）（t=4.893，P<0.01），而B(niǎo)cl2L 11+miRNA?NC組相對(duì)熒光活性（1.053±0.024）與BCL 2L 11?MUT+miRNA?NC組（1.007±0.055）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.771，P=0.483），見(jiàn)圖4B。Western blot檢測(cè)顯示，miR?186 mimic組中Bcl2L 11蛋白相對(duì)表達(dá)（0.306 7±0.020 0）明顯低于NC組（0.733±0.029）（t=12.04，P<0.01），見(jiàn) 圖4C、D。以上結(jié)果表明Bcl2L 11是miR?186調(diào)控的靶基因，并通過(guò)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)結(jié)合。

圖4 miR?186靶向下調(diào)Bcl2L 11基因表達(dá)Fig 4 miR?186 doenregulated the expression of Bcl2L11

3 討論

COPD是一種常見(jiàn)的氣流受限、呈進(jìn)行性發(fā)展為特征的慢性疾病，目前COPD居全球死亡原因的第4位［11］。WHO和世界銀行的一項(xiàng)研究表明，2020年COPD會(huì)成為世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的第5位［12］。中國(guó)的COPD發(fā)病率為4%～6%，40歲以上的人群發(fā)病率為8.2%，其中男性為10.37%，女性為4.75%，嚴(yán)重危害著人民群眾的健康［13］。COPD的臨床研究尚且不能溯本求源。日益惡化的環(huán)境污染和人口的老齡化，都導(dǎo)致COPD的發(fā)病率升高，病程越來(lái)越復(fù)雜［12，14］。因此，需要進(jìn)一步從不同角度闡明COPD的發(fā)病機(jī)制。

外泌體（exosomes）是細(xì)胞釋放的含有一些特殊蛋白如CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、TSG101的囊泡結(jié)構(gòu)，具有完整磷脂雙分子層，粒徑40～100 nm［15］。本研究中鑒定的外泌體特征符合以上特征。目前已發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)miRNA參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如神經(jīng)疾?。?6］、腫瘤［17］、COPD［18］等，提示外泌體包含的miRNA可能在疾病的進(jìn)展中起到重要的作用。支氣管上皮細(xì)胞衍生的miR?210則通過(guò)靶向調(diào)控ATG7基因表達(dá)直接調(diào)節(jié)自噬過(guò)程影響COPD的進(jìn)展［19］。另一個(gè)源于支氣管上皮細(xì)胞的外泌體miR?21則在吸煙引起的COPD中異常表達(dá)，可能作為COPD診斷或治療的靶點(diǎn)［20］。

大量研究證實(shí)，miR?186在多種疾病中表達(dá)異常［21］。miR?186通過(guò)與circ0008305結(jié)合促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)［22］。miR?186?5p通過(guò)靶向FOXK 1在人骨肉瘤中發(fā) 揮 腫 瘤 抑 制 作 用［23］。此 外，mir?186通 過(guò) 調(diào) 控IGF?1影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡［24］。miR?186靶向HIF?1α基因參與調(diào)控COPD成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡［25］。但對(duì)于支氣管來(lái)源的外泌體miR?186對(duì)COPD成纖維細(xì)胞的影響尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，CSE處理能夠明顯誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞16HBE分泌外泌體miR?186。使用16HBE細(xì)胞上清中的外泌體miR?186培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞MRC?5，能明顯提高M(jìn)RC?5的增殖活力。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Bcl2L 11是miR?186的靶基因，采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明了miR?186通過(guò)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合Bcl2L 11。此外，miR?186 mimic明顯抑制了Bcl2L 11的表達(dá)。本研究也具有一定的局限性：（1）未能從臨床樣本或動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)論。（2）對(duì)miR?186靶向抑制Bcl2L 11后調(diào)控的下游通路還未能進(jìn)一步證明。筆者將延續(xù)本研究在臨床樣本與動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證香煙誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞外泌體mir?181對(duì)肺成纖維細(xì)胞的影響，并進(jìn)一步探討該途徑下游調(diào)控的通路進(jìn)而促進(jìn)COPD疾病的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究表明CSE誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞16HBE分泌的外泌體mir?181，通過(guò)外泌體進(jìn)入對(duì)肺成纖維細(xì)胞后，能夠靶向抑制Bcl2L 11促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖。這可能是CSE促進(jìn)COPD肺成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，可能作為COPD臨床干預(yù)手段的理論依據(jù)。

所有作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

徐冬川：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，文章寫(xiě)作；何蟬伊：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；林琦：部分實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；丁毅鵬：實(shí)驗(yàn)統(tǒng)籌安排。