胡 倩，錢婉智，鄒純才，鄢海燕

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖241002）

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或 雙 邊 栝 樓（Trichosan?thesros?thorniiHarms）的成熟果實(shí)，其果皮和種子即瓜蔞皮和瓜蔞子［1］皆可入藥。由于瓜蔞不易保存，臨床及科研工作中常以不同比例的瓜蔞皮和瓜蔞子代替瓜蔞入藥［2］。黃酮類化合物是一種天然藥理活性成分，具有抗胃潰瘍等作用［3，4］，它通過抑制胃酸過度分泌，降低胃蛋白酶活性，抑制胃潰瘍的產(chǎn)生，促進(jìn)潰瘍的愈合來發(fā)揮抗胃潰瘍的作用［5］。有研究表明瓜蔞具有抗胃潰瘍作用［6，7］，瓜蔞中黃酮類化合物成分可能是瓜蔞抗胃潰瘍作用的有效成分［8］。瓜蔞皮與瓜蔞子的比例、提取溶劑、提取時(shí)間與提取溫度等因素都可能影響瓜蔞中總黃酮的提取率，同時(shí)在對(duì)瓜蔞中總黃酮含量測(cè)定時(shí)，需采用差示分光光度法消除干擾因素對(duì)總黃酮含量測(cè)定的影響。因此本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合差示分光光度法優(yōu)化瓜蔞中總黃酮的提取工藝，為瓜蔞中總黃酮的提取及后續(xù)瓜蔞抗胃潰瘍研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

UV 1800型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；AUW-220D型電子天平（日本島津公司）；Hei?dolph-LR4010/4011旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道爾夫公司）；瓜蔞皮（河北安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司，批號(hào)：20171202）；瓜蔞子（河北安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司，批號(hào)：20200420）；蘆?。ǔ啥计辗频律锛夹g(shù)有限公司，純度≥95%，批號(hào)：151023）；三氯化鋁（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)：20150604）；無水乙酸鈉（上海展云化工有限公司，批號(hào)：191010）；冰醋酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160802）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 0.1 mol/L三氯化鋁溶液 精密稱取三氯化鋁1.333 6 g，置于100 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得。

1.2.1.2 1 mol/L醋酸溶液 精密量取58.8 mL的冰醋酸至1 L的量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即得。

1.2.1.3 醋酸鈉-醋酸緩沖液（p H=5.62） 取無水乙酸鈉10.0 g精密稱定，用20 mL的1 mol/L醋酸溶液溶解，加蒸餾水稀釋至50 mL，即得。

1.2.1.4 蘆丁對(duì)照品溶液 取0.01 g蘆丁，精密稱定，置于50 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液7.5 mL置于10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，即得濃度為150μg/mL的蘆丁對(duì)照品稀釋液。

1.2.1.5 樣品溶液的制備 取20 g瓜蔞皮和30 g瓜蔞子（在40℃烘箱中烘干），精密稱定，按照料液比1∶10（g/mL）［9］加入70%乙醇溶液，常溫下浸泡30 min，置于超聲清洗機(jī)（功率200 W，40 Hz）于40℃超聲提取3次，每次60 min，合并濾液，4℃下靜置12 h，過濾，取濾液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑得浸膏，浸膏用20 mL的蒸餾水洗至分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層并回收溶劑。殘?jiān)脽o水乙醇溶解并定容至5 mL的量瓶中，備用。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定方法的建立

1.2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取適量的蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液，分別以無水乙醇為參比，掃描蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液顯色前的光譜圖；取適量的蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液和醋酸鈉-醋酸緩沖液（V∶V∶V=1∶2∶1，全文同），室溫顯色30 min，以同法處理的無水乙醇、0.1 mol/L三氯化鋁溶液和醋酸鈉-醋酸緩沖液為參比，掃描蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液顯色后的光譜圖。比較蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液顯色前、后的光譜圖，確定樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取蘆丁對(duì)照品稀釋液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL分別置于10 mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，配備成濃度為0.75、1.5、3、6、12、24μg/mL的儲(chǔ)備液，以無水乙醇為參比，在421 nm測(cè)定吸光度，記為A1；精密量取蘆丁對(duì)照品稀釋液（150μg/mL）0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL分別置于10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液，無水乙醇定容至刻度，室溫顯色30 min［10］，以無水乙醇、三氯化鋁溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液為參比，在421 nm處測(cè)定吸光度A2；計(jì)算相同濃度蘆丁組顯色前后的吸光度差值ΔA(ΔA=A2-A1)。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密量取150μg/mL的蘆丁對(duì)照品稀釋液0.2 mL于10 mL的量瓶中，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，平行測(cè)定5次，記錄ΔA值。

1.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取0.2 mL同一樣品溶液于10 mL的量瓶中，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，分別于0、15、30、45、60、75 min測(cè)定，記錄ΔA值。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批瓜蔞藥材（批號(hào)：20171202、20200420），按“1.2.1.5”項(xiàng)下方法制備樣品5份，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，記錄ΔA值。

1.2.3.4 回收率試驗(yàn) 取已知總黃酮含量的樣品溶液9份，分別精密量取適量的蘆丁對(duì)照品溶液置于樣品溶液中（蘆丁質(zhì)量分別為所取樣品溶液中總黃酮質(zhì)量的80%、100%和120%，各3份），按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，平行測(cè)定3次，記錄ΔA值，計(jì)算樣品加樣回收率。

1.2.4 單因素考察 在相關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上［11-13］，以瓜蔞皮和瓜蔞子的比例（以下簡(jiǎn)稱皮子比例）、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，皮子比例設(shè)為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7，乙醇濃度設(shè)為50%、60%、70%、80%、90%，提取時(shí)間設(shè)為30、45、60、75、90 min，提取溫度設(shè)為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。以樣品顯色前后的吸光度差值ΔA為評(píng)價(jià)指標(biāo)，判斷各單因素中最優(yōu)條件，為下一步響應(yīng)面優(yōu)化提供依據(jù)。

1.2.4.1 皮子比例的影響 按照“1.2.1.5”項(xiàng)下的方法，設(shè)置皮子比例7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7進(jìn)行超聲提取，制備5批樣品溶液，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，記錄ΔA值。

1.2.4.2 乙醇濃度的影響 按照“1.2.1.5”項(xiàng)下的方法，皮子比例定為5：5、設(shè)置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行超聲提取，制備5批樣品溶液，按“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理，記錄ΔA值。

1.2.4.3 提取時(shí)間的影響 按照“1.2.1.5”項(xiàng)下的方法，皮子比例定為5∶5，乙醇濃度定為80%，設(shè)置時(shí)間為30、45、60、75、90 min進(jìn)行超聲提取，制備樣品溶液，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，記錄ΔA值。

1.2.4.4 溫度的影響 按照“1.2.1.5”項(xiàng)下的方法，皮子比例定為5∶5，乙醇濃度定為80%，提取時(shí)間定為60 min，設(shè)置溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進(jìn)行超聲提取，制備樣品溶液，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，記錄ΔA值。

1.2.5 Box?Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)工藝［14-16］

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇皮子比例（A）、乙醇濃度（B）、提取時(shí)間（C）及提取溫度（D）為考察因素，以平行測(cè)定三次結(jié)果的平均值ΔA（Y）為指標(biāo)，采用4因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化瓜蔞中總黃酮的提取工藝。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

通過掃描蘆丁對(duì)照品和樣品溶液在250～750 nm處的紫外-可見光譜圖，發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)照品和樣品溶液顯色后均在421 nm處存在最大吸收峰，但是樣品顯色前在421 nm波長(zhǎng)也有吸收，因此不能采用紫外-可見分光光度法直接測(cè)定樣品顯色后的吸光度來計(jì)算總黃酮的含量。為了提高總黃酮含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，排除干擾物質(zhì)的影響［17，18］，可采用差示分光光度法于421 nm波長(zhǎng)處測(cè)定瓜蔞中的總黃酮含量，見圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照品和樣品顯色前后的光譜圖及差示光譜圖Fig 1 Spectr ogram and differ ential spectr ogram of r utin reference substance and sample befor e and after color ation

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法，以ΔA為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品稀釋液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為ΔA=0.036 2C-0.024，r=0.9992，結(jié)果表明蘆丁在0.75～24μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度 按“1.2.3.1”項(xiàng)下方法，精密度試驗(yàn)RSD值為1.38%，表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性 按“1.2.3.2”項(xiàng)下方法，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值為0.33%，表明樣品在顯色后75 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性 按“1.2.3.3”項(xiàng)下方法，重復(fù)性試驗(yàn)RSD值為1.65%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 回收率 按“1.2.3.4”項(xiàng)下方法，平均回收率結(jié)果為95.1%，加樣回收率試驗(yàn)RSD值為2.09%，表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.4 單因素考察

按“1.2.4”項(xiàng)下方法確定皮子比例、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)瓜蔞中總黃酮含量的影響。由圖2可知，ΔA會(huì)隨著瓜蔞子所占比例的增加而先增大后減小，當(dāng)皮子比例為5∶5時(shí)，ΔA值最大。由圖3可知，ΔA會(huì)隨著乙醇濃度的增大而先增大后減小，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，ΔA值最大。由圖4可知，ΔA會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而先增大后減小，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，ΔA值最大。由圖5可知，ΔA會(huì)隨著提取溫度的升高而先增大后減小，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，ΔA值最大。

圖2 不同皮子比例的ΔA值（n=3）Fig 2 ΔA value of different proportions of Trichosanthis per icar pium and Trichosanthis semen（n=3）

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

圖3 不同乙醇濃度的ΔA值（n=3）Fig 3 ΔA values of different ethanol concentrations（n=3）

圖4 不同提取時(shí)間的ΔA值（n=3）Fig 4 ΔA values at different extraction time points（n=3）

圖5 不同提取溫度的ΔA值（n=3）Fig 5 ΔA values at different extraction temperatures（n=3）

2.5.1 Box?Behnken試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 試驗(yàn)各因素和水平設(shè)計(jì)見表1。通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，共需進(jìn)行29組試驗(yàn)，結(jié)果見表2，對(duì)29組試驗(yàn)的ΔA進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。模型F=7.21，P<0.001，說明實(shí)驗(yàn)采用的二次多項(xiàng)式回歸方程模型是顯著的；失擬項(xiàng)P=0.787 1>0.05，無顯著性差異，說明此回歸模型擬合程度較好，因此可通過這個(gè)模型來反映瓜蔞中總黃酮的提取工藝中各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

回歸方程為：Y=0.29-3.083×10-4A-0.041B+8.992C×10-3-0.015D+0.011AB+6.588×10-3AC-0.022AD+0.028BC+0.018BD-0.016CD-0.030A2-0.038 B2-0.039C2-4.360×10-3D。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab 1 Experimental factors and levels of Box-Behnken re?sponse surface method

表2 Box-Behnken試驗(yàn)安排及結(jié)果Tab 2 Testarrangementand results of Box-Behnken re?sponse surface method

表3 響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析Tab 3 Analysis of variance in response surface regression models

2.5.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 使用Design-Ex?pert8.0.6軟件，選擇對(duì)各指標(biāo)有顯著影響的2個(gè)因素，做出相應(yīng)的曲面圖，見圖6。

圖6反映的是皮子比例、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)ΔA的影響。從三維效應(yīng)圖中可知各影響因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，曲面越陡，說明影響越大。從圖6Ⅰ～Ⅲ可知ΔA值隨著乙醇濃度的增加先增大后減小，由圖6Ⅱ、Ⅳ可知ΔA隨提取溫度的升高而降低。

圖6 各因素對(duì)響應(yīng)值影響的三維效應(yīng)曲面圖Fig 6 Three-dimensional effect surface diagrams of the influence of various factors on response values

2.5.3 優(yōu)選工藝的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 采用Design-Ex?pert8.0.6軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的優(yōu)化工藝條件為A=4∶6，B=74.5%，C=63.15 min，D=40℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作情況，確定最佳工藝條件為A=4∶6，B=70%，C=60 min，D=40℃，即選擇皮子比例為4∶6，乙醇濃度為70%，提取時(shí)間60 min，提取溫度40℃。根據(jù)該工藝條件，經(jīng)三次驗(yàn)證試驗(yàn)，ΔA平均值為0.308，RSD＝0.65%，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果ΔA為0.309。結(jié)果顯示實(shí)際測(cè)定結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果差值為?0.001，表明優(yōu)化后的提取工藝可行。

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道［10］，以三氯化鋁為顯色劑，采用紫外可見分光光度法來直接測(cè)定提取物中總黃酮的含量較為方便快捷。但現(xiàn)有文獻(xiàn)多未考慮在所選擇的測(cè)定波長(zhǎng)處非黃酮類物質(zhì)的干擾吸收，影響了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。在本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，瓜蔞總黃酮提取物樣品以三氯化鋁顯色前、后，在所選擇的421 nm波長(zhǎng)處均有吸收，若采用三氯化鋁顯色后于421 nm波長(zhǎng)處直接測(cè)定總黃酮含量，將使測(cè)得的總黃酮含量偏高，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。差示分光光度法的數(shù)學(xué)原理簡(jiǎn)單，易于接受，同時(shí)由于該方法既保留了通常的分光光度法簡(jiǎn)單、快速、直接讀數(shù)的優(yōu)點(diǎn)，又能消除干擾，從而受到廣大藥物分析工作者的青睞。為此，鑒于瓜蔞提取物在三氯化鋁顯色前后表現(xiàn)出各自不同的光譜特征，本文采用差示分光光度法消除了非黃酮類物質(zhì)的干擾吸收，準(zhǔn)確測(cè)定了瓜蔞提取物中總黃酮的含量。

影響顯色法定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度的因素較多。因此，采用三氯化鋁顯色法測(cè)定瓜蔞中總黃酮含量時(shí)，要注意控制顯色時(shí)間，降低人為因素造成的吸光度波動(dòng)。在本文的單因素考察和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)工藝中，均設(shè)置了平行試驗(yàn)（n=3），考察了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精密度對(duì)結(jié)果的影響，提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了瓜蔞中黃酮的提取工藝，確定最佳工藝條件為瓜蔞皮和瓜蔞子的比例為4∶6、乙醇濃度為70%、超聲提取時(shí)間為60 min和超聲提取溫度為40℃。

作者貢獻(xiàn)度說明：

胡倩：撰寫論文，承擔(dān)了所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，錢婉智：協(xié)助藥材的提取，鄒純才、鄢海燕：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。