鄭修齊 呂小會(huì) 張?chǎng)?趙嫄 熊朝剛

(西安市胸科醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710100)

長(zhǎng)期過(guò)量的酒精攝入會(huì)造成酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)的發(fā)生。ALD是一種復(fù)雜的病理性過(guò)程，根據(jù)不同的病理表現(xiàn)可分為脂肪肝，肝炎，肝纖維化及肝硬化。有研究[1-2]顯示，氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是酒精引起肝損傷的主要機(jī)制。有研究[3-4]顯示，ERS參與到ALD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，與此同時(shí)，ERS還會(huì)引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5]。姜黃素是姜黃的主要生物活性成分，可作為抗氧化劑及消炎藥在中草藥治療中使用[6]。有研究結(jié)果顯示，姜黃素及其類(lèi)似物對(duì)病毒性肝炎及乙醇性肝損傷具有很強(qiáng)的保肝作用[7]，然而姜黃素是否可以通過(guò)抗氧化作用緩解線(xiàn)粒體損傷并且降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白IRE1α及NF-B的表達(dá)，從而抑制ALD中炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)酒精引起的肝臟損傷起到保護(hù)作用仍尚不明確。本研究探討姜黃素(Curcumin)對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷模型(ALD)的影響，并研究其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與實(shí)驗(yàn)器材 姜黃素購(gòu)于國(guó)家食品藥品研究所(北京，中國(guó))；北京紅星二鍋頭；MDA檢測(cè)試劑盒(中國(guó)，碧云天)；GRP78(1:1 000)，p-ERK、ERK(1:1 000)，IRE1α(1:500)，NF-B(1:800)及GAPDH(1:2 000)均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司(美國(guó))；IL-1β及IL-6引物合成與生工有限公司。倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS BX53M)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)，Thermo Fisher Scientific)；電泳儀(美國(guó)，BIO-RAD)；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)，BIO-RAD)；酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo Fisher Scientific)；全自動(dòng)組織石蠟切片機(jī)(德國(guó)，Leica)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)，Applied Biosystems)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性C57BL/6J小鼠(8周齡，約23 g)購(gòu)于北京維通利華公司，隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組、姜黃素單獨(dú)給藥組、ALD組、姜黃素+ALD組，各10只。全部操作被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。各組小鼠處理方式如下：對(duì)照組給予食用油灌胃(10 mL/kg)；姜黃素單純給藥組的小鼠給予劑量為150 mg/kg的姜黃素灌胃處理；除對(duì)照組與姜黃素單純給藥組外，ALD組與姜黃素+ALD組小鼠均給予56度紅星二鍋頭以10 mL/kg灌胃2周；兩周后灌胃濃度升高為12 mL/kg，灌胃2周；接下來(lái)的4周灌胃劑量改為15 mL/kg。姜黃素溶解在食用油中進(jìn)行灌胃。在進(jìn)行酒精灌胃1 h前，對(duì)姜黃素單純給藥組與姜黃素+ALD組小鼠進(jìn)行姜黃素灌胃[8]。

1.2.2蘇木精-伊紅染色(H&E) 取各組小鼠肝臟組織石蠟切片，二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇脫水處理后，將切片浸泡于蒸餾水中清洗，用蘇木素(索萊寶)對(duì)組織的細(xì)胞核染色9 min，蒸餾水清洗后，用鹽酸酒精分化液分化10 s，蒸餾水再次清洗10 min后用伊紅試劑染色3 min，用蒸餾水清洗切片5 min后，75%酒精中脫色10 s左右，二甲苯中固定15 min，然后采用中性樹(shù)脂封片，在倒置電子顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.2.3小鼠肝臟組織MDA含量的測(cè)定 MDA是膜脂過(guò)氧化的常用指標(biāo)，在高溫酸性環(huán)境下，MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物為紅棕色的三甲川，三甲川的最大吸收波長(zhǎng)為532 nm，可通過(guò)測(cè)定三甲川的含量來(lái)計(jì)算組織中MDA的含量[9]。取各組小鼠肝臟組織1 g，加入樣本提取液，進(jìn)行研磨，勻漿在4 000 r·min-1離心10 min，取上清；吸取肝組織上清液2 mL，對(duì)照組加入2 mL的蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組加入2 mL 0.6%三氯乙酸溶液，反復(fù)混勻反應(yīng)物，將其置于沸水浴中充分反應(yīng)15 min后，置于冰中將其迅速冷卻，離心。取上清液在酶標(biāo)儀532 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定OD值，根據(jù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及其對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出樣本的MDA的含量。

1.2.4Western Blot 將各組小鼠肝臟組織及各組細(xì)胞置于4 ℃的裂解緩沖液中裂解。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(美國(guó)，Thermo Fisher)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白(30 μg)加到提前配好的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，電泳后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)恒流轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜浸泡于在5%的脫脂乳中封閉30 min，然后將PVDF與相應(yīng)的一抗孵育在4 ℃搖床中過(guò)夜。第2天，將PVDF膜取出，將PVDF膜置于TBST中清洗3次，5 min/次；根據(jù)一抗的來(lái)源將PVDF膜浸泡于對(duì)應(yīng)的二抗中孵育60 min；清洗PVDF膜，5 min/次，共3次；將PVDF膜浸泡于ECL發(fā)光液中，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光。

1.2.5Real-time PCR 將各組小鼠部分肝臟組織放于提前預(yù)冷的研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，反復(fù)研磨至管內(nèi)沒(méi)有明顯組織殘塊，分別加入1 mL TRIzol，吸取液體于提前預(yù)冷的EP管中。每管中加入200 μl的氯仿，靜置至管內(nèi)液體分層；再往復(fù)混勻液體2次，靜置5 min；4℃下，以13 300 rpm離心15 min。吸取最上層液體置于新的EP管中，加入500μl的異丙醇溶液，將液體充分混勻，靜置5 min后，4℃下，以13 300 rpm離心15 min。離心后，棄去管內(nèi)液體，加入1 mL提前預(yù)冷的濃度為75%的乙醇，清洗RNA；離心15 min，離心后，棄去管中液體，再在離心機(jī)中空轉(zhuǎn)5 min；空轉(zhuǎn)后，吸去多余液體，將敞開(kāi)管蓋的EP管置于室溫中，待白色RNA沉淀變?yōu)橥该?，加?0μlDEPC水，反復(fù)吹打充分溶解RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后在寶生物Real-Time PCR儀上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以均值Mean±SD來(lái)表示，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以單因素方差分析(One-way ANOVA)方法進(jìn)行分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素對(duì)ALD小鼠肝損傷的影響 本實(shí)驗(yàn)探討姜黃素對(duì)ALD小鼠肝損傷的影響，通過(guò)H&E染色可觀察到，對(duì)照組小鼠肝臟組織顏色暗紅且被膜光滑；ALD模型組小鼠肝臟可見(jiàn)血管周?chē)屑?xì)胞核的聚集，組織細(xì)胞內(nèi)有明顯空泡結(jié)構(gòu)；在經(jīng)過(guò)姜黃素處理后，ALD小鼠肝臟血管周?chē)?xì)胞核聚集明顯減少，且肝細(xì)胞內(nèi)空泡也明顯減少(如圖1)。

圖1 不同組小鼠肝臟的病理情況

2.2姜黃素對(duì)ALD小鼠肝臟MDA含量的影響 檢測(cè)各組小鼠肝臟中MDA的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALD組小鼠肝臟中MDA的含量明顯高于對(duì)照組，而在經(jīng)過(guò)姜黃素處理后的ALD小鼠肝臟中MDA含量則明顯減少(如圖2)。

注：與對(duì)照組比較, *P < 0.05, 與ALD組比較, #P < 0.05。

2.3姜黃素對(duì)ALD小鼠肝臟中ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果顯示，在ALD模型小鼠肝臟中GRP78蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組小鼠；而經(jīng)過(guò)姜黃素預(yù)處理后，ALD小鼠肝臟中的GRP78蛋白的表達(dá)量明顯降低。為了確認(rèn)飲酒是否會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子蛋白，我們還檢測(cè)了p-ERK蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在ALD小鼠肝臟中p-ERK蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組小鼠的，經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，ALD小鼠肝臟中的p-ERK蛋白表達(dá)量則明顯降低 (如圖3)。

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05,與ALD組比較,#P<0.05。

2.4姜黃素對(duì)ALD小鼠肝臟中IRE1α及NF-B蛋白表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，ALD組小鼠肝臟中IRE1α及NF-B的蛋白表達(dá)較對(duì)照組小鼠相比，明顯升高；經(jīng)姜黃素與處理后，IRE1α及NF-B的蛋白表達(dá)則顯著降低(如圖4)。

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05, 與ALD組比較,#P<0.05。

2.5姜黃素對(duì)ALD小鼠肝臟中IL-1β與IL-6基因表達(dá)的影響 在本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了NF-B下游信號(hào)通路IL-1β與IL-6基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在ALD組小鼠肝臟中IL-1β與IL-6基因的表達(dá)較對(duì)照組小鼠相比明顯上調(diào)；經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，ALD小鼠肝臟中IL-1β與IL-6基因的表達(dá)明顯下調(diào)(如圖5)。

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05,與ALD組比較,#P<0.05。

3 討 論

酒精性肝病現(xiàn)已成為威脅全球人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病之一[10-11]。機(jī)體內(nèi)乙醇的過(guò)度攝入，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[8]?，F(xiàn)有大量研究結(jié)果顯示，ERS參與ALD的發(fā)病過(guò)程[1]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，也是未折疊蛋白反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子,其主要功能是協(xié)調(diào)蛋白折疊裝配及錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)和控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器的激活，是細(xì)胞維持正常功能的重要調(diào)節(jié)蛋白[12]。前期研究結(jié)果顯示，在慢性酒精暴露的豬模型中，GRP78與caspase-12的轉(zhuǎn)錄水平與肝臟的脂肪變性呈正相關(guān)[13]。而在小鼠的酒精肝模型中也發(fā)現(xiàn)了GRP78與IRE1表達(dá)的上調(diào)[12]。ERS還會(huì)引起一些炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其中主要是NF-B介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。NF-B是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用[14-15]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，ERS可導(dǎo)致NF-B的活化[16]。在心肌炎癥反應(yīng)中，ERS還可以通過(guò)激活I(lǐng)RE1α上調(diào)NF-B的表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)[14-15]。

姜黃素是姜黃的主要活性成分，可作為抗氧化劑及抗炎藥物使用[6]。先前的研究結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)肝臟具有明顯的保護(hù)作用[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，為了探討姜黃素對(duì)ALD小鼠肝臟的相關(guān)作用，我們檢驗(yàn)了經(jīng)姜黃素預(yù)處理后的ALD小鼠肝臟中MDA的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)姜黃素預(yù)處理后，ALD小鼠肝臟中MDA的含量明顯降低，這說(shuō)明姜黃素對(duì)酒精引起的ROS的升高具有一定的抑制作用，姜黃素具有一定的抗氧化效果。檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白GRP78與p-ERK的表達(dá)情況，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)姜黃素預(yù)處理后，ALD小鼠肝臟細(xì)胞中的GRP78與p-ERK蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示在經(jīng)過(guò)姜黃素預(yù)處理后，ALD小鼠肝臟細(xì)胞中的ERS得到了抑制。進(jìn)一步檢驗(yàn)IRE1α、NF-B蛋白及IL-1β、IL-6基因的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后，在ALD小鼠肝臟中IRE1α、NF-B蛋白及IL-1β、IL-6基因的表達(dá)均明顯下降，這說(shuō)明姜黃素的預(yù)處理明顯降低了酒精引起的小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)。因此，姜黃素可通過(guò)抑制ALD小鼠肝臟的ROS水平，抑制ERS的發(fā)生，降低NF-B介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。揭示姜黃素可作為一種天然的抗ALD的藥物，為ALD的預(yù)防與治療提過(guò)相關(guān)依據(jù)與方法。