葉青，趙敏，冉紫晶，張?jiān)婄?，梅小?/p>

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000

乙型肝炎病毒（HBV）為一種嗜肝病毒，其引發(fā)相關(guān)性肝病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。最早的研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4可直接介導(dǎo)機(jī)體與HBV等病原體間的免疫反應(yīng)，在TLR-4識(shí)別HBV等受體后啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)通路而促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞因子分泌而發(fā)揮抗HBV等作用，導(dǎo)致肝組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，外周血單核細(xì)胞（PBMCs）表面及肝組織中均可檢出不同水平的HBV表達(dá)，其HBV誘導(dǎo)了肝細(xì)胞損傷，這可能與HBV基因型變異、病毒蛋白水平高表達(dá)、宿主過度的抗HBV免疫反應(yīng)、腫瘤壞死因子介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等因素相關(guān)。在CHB等肝病患者中宿主抗HBV的過度免疫反應(yīng)是目前較公認(rèn)的肝臟損傷機(jī)制之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，Tim基因有8個(gè)基因亞型，共編碼4種蛋白，人類僅編碼Tim-1、Tim-3和Tim-4三種基因亞型，其中Tim-3為一種負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，常表達(dá)于激活后的單核細(xì)胞等表面，Tim-3配體可與HBV等病原體結(jié)合參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3在T淋巴細(xì)胞表面失常性表達(dá)與CHB患者免疫功能紊亂等密切相關(guān)，可能是CHB等肝病患者的發(fā)病機(jī)制之一［3］。Tim-3和TLR-4均在單核細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，其在CHB中的研究為目前的熱點(diǎn)之一，但二者與CHB病情的關(guān)系仍無(wú)定論。本研究以CHB患者為研究對(duì)象，以無(wú)HBV感染的健康體檢者、HBV攜帶者為對(duì)照進(jìn)行研究。觀察其外周血中PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平表達(dá)變化，并探討其二者之間及二者與CHB病情嚴(yán)重程度的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年1月-2020年8月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診或住院部就診的CHB患者190例（CHB組），同期25例HBV攜帶者（攜帶組）及25例無(wú)HBV感染的健康體檢者（健康組），診斷標(biāo)準(zhǔn)為2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的CHB防治指南［4］，依據(jù)傳染病學(xué)第九版對(duì)CHB患者病情程度進(jìn)行分度。納入標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象均知情同意者；近6個(gè)月CHB患者均未接受免疫與抗HBV治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嗜肝或非嗜肝病毒感染；不明原因肝炎；妊娠期或者哺乳期婦女。CHB組中男139例、女51例，年齡18～68（40.21±15.26）歲，CHB輕度組、CHB中度組、CHB重度組分別為90、70、30例。健康組中男16例、女9例，年齡18～67（41.08±14.08）歲；攜帶組中男17例、女8例，年齡18～60（41.39±16.39）歲。三組年齡、性別構(gòu)成比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

1.2 PBMCs表面Tim-3、TLR-4的檢測(cè)采集研究對(duì)象外周靜脈血3 mL后，分離PBMCs采用Ficol-Hypaque密度離心法，用Ficoll-hypzue分離液（淋巴細(xì)胞分離液）分離PBMCs，以0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞，將PBS液一倍稀釋后加至淋巴細(xì)胞分離液上層，以2 500 r/min轉(zhuǎn)速離心25 min后采取單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層，2次用PBS再洗滌后即可獲取PBMCs并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

用流式CD16、CD56和Tim-3及單標(biāo)和同型對(duì)照標(biāo)志物加入3 mL UPBMCs中，用4%多聚甲醛溶液500 μL固定后上機(jī)檢測(cè)，并獲取PBMCs表面Tim-3的表達(dá)水平。將CD14、CD282、TLR-4抗體、同型對(duì)照物加入U(xiǎn)PBMCs中混勻，避光孵育30 min加入PBS液離心兩次后棄上清液，4%多聚甲醛溶液固定后置于流式細(xì)胞儀上，選定單核細(xì)胞門檢測(cè)TLR-4。

1.3 血清中HBV感染標(biāo)志物及肝功能檢測(cè)采用德國(guó)西門子公司生產(chǎn)的ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)肝功能指標(biāo)。乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)試劑為Abbott公司產(chǎn)品；HBV DNA Taqman熒光定量PCR試劑為上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析；采用Pearson法分析各因素間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平比較CHB患者外周血PBMCs表面Tim-3、TLR-4表達(dá)水平均高于健康組和攜帶組（t1=-13.705，t2=-13.412；t1=-28.767，t2=-28.044P均＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 三組PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平（±s）

表1 三組PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平（±s）

組別CHB組攜帶組健康組n 190 25 25 Tim-3（pg/mL）332.06±179.73 112.58±61.07 115.86±56.49 TLR-4（ng/mL）12.81±8.62 1.25±0.14 1.04±0.99

2.2 CHB患 者PBMCs表面Tim-3及TLR-4與 患 者病情的關(guān)系CHB輕度組、CHB中度組、CHB重度組PBMCs表面Tim-3水平分別為（206.38±17.15）、（387.91±42.50）、（695.72±93.12）pg/mL，TLR-4分 別為（6.37±1.25）、（12.29±1.43）、（18.01±1.34）ng/mL，不同組間兩兩比較，P均＜0.05。

PBMCs表 面Tim-3及TLR-4均與病情程 度呈正相關(guān)（r分別為0.916、0.917，P均＜0.05）。

2.3 CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平之間及其與肝功能指標(biāo)之間的關(guān)系CHB患者PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平間呈正相關(guān)（r=0.318，P=0.000）。Tim-3水平與ALT［（406.47±337.68）U/L］、AST［（303.78±294.52）U/L］均 呈 正 相 關(guān)（r=0.940，P=0.000；r=0.928，P=0.000），TLR-4水平與ALT、AST水平也呈正相關(guān)（r=0.318，P=0.000；r=0.341，P=0.000）。Tim-3及TLR-4水平與HBV DNA［（5.61±1.94 IU）/mL）］呈負(fù)相關(guān)（r=-0.374，P=0.000；r=-0.152，P=0.000）。

3 討論

CHB患者免疫功能紊亂可能是機(jī)體不能完全清除HBV或炎癥反應(yīng)發(fā)生與慢性化的原因之一［5-6］，肝細(xì)胞的免疫損傷是CHB等HBV相關(guān)性肝病患者肝損傷的主要發(fā)生機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3對(duì)CHB等患者的免疫功能發(fā)揮著負(fù)向調(diào)控作用，在與半乳糖凝素-9結(jié)合后為T淋巴細(xì)胞等單核細(xì)胞提供負(fù)性共刺激信號(hào)并形成信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)Th1、Th2及Th17等細(xì)胞因子活性與水平表達(dá)，從而通過降低促炎性因子水平來(lái)調(diào)控適應(yīng)性炎癥反應(yīng)與纖維化的發(fā)生［7］。研究發(fā)現(xiàn)，模式識(shí)別受體族中最重要的受體之一是TLRs受體，可在識(shí)別HBV等病原體后發(fā)揮免疫功能的調(diào)節(jié)作用［8］。TLRs模式識(shí)別受體家族中至少有10種，TLR-4受體為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于主要表達(dá)于單核細(xì)胞等細(xì)胞表面的TLRs，可發(fā)揮人體固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，對(duì)分布于肝星狀細(xì)胞（HSC）膜上TLRs，可通過激活HSC標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），從而發(fā)揮下調(diào)膠原蛋白基質(zhì)蛋白酶-2（MMP-2）水平的作用，進(jìn)而促進(jìn)HSC激活并轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞而使膠原纖維蛋白原上調(diào)，導(dǎo)致肝組織炎癥發(fā)生與肝纖維化形成。研究發(fā)現(xiàn)，在肝組織炎癥發(fā)生形成時(shí)，其外周血LPS可上調(diào)TLR-4表達(dá)水平，并與肝組織炎癥的發(fā)生及炎癥程度密切相關(guān)，在一定程度上反映了CHB患者病情程度［9］。CHB等患者PBMCs表面的Tim-3在免疫功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控作用，Tim-3與相應(yīng)受體結(jié)合后為受感染細(xì)胞提供負(fù)性共刺激信號(hào)并激活相關(guān)信號(hào)通路，抑制Th1細(xì)胞活性而促進(jìn)炎性因子水平下調(diào)，通過Th17細(xì)胞發(fā)揮抑制適應(yīng)性炎癥反應(yīng)的作用，從而對(duì)CHB患者炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及程度發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果顯示，CHB患者PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平與HBV DNA載量間呈負(fù)相關(guān)系（r=-0.374，P=0.000；r=-0.152，P=0.000），與 喻 雪 琴等［5-10］的研究結(jié)果相一致，這可能與CHB等HBV相關(guān)性肝病患者體內(nèi)HBV長(zhǎng)期存在相關(guān)，HBV在與肝細(xì)胞核結(jié)合后，外周血中游離的HBV水平低表達(dá)，此時(shí)Tim-3及TLR-4高表達(dá)于單核細(xì)胞表面，特別是CD8+T細(xì)胞，通過觸發(fā)Galectin-9而引發(fā)自身凋亡，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞耗竭而降低抗HBV的作用，從而使乙肝病程慢性化。另外，低水平表達(dá)的HBV在機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在，也可通過多路徑來(lái)誘導(dǎo)激活HSC，導(dǎo)致肝細(xì)胞受損后的炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)生，從而啟動(dòng)PBMCs表面Tim-3及TLR-4活化進(jìn)程并高水平表達(dá)，抑制HBV DNA復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，肝組織內(nèi)Tim-3及TLR-4水平可隨CHB患者外周血HBV DNA載量增加而上調(diào)，提示HBV DNA水平與Tim-3、TLR-4水平關(guān)系密切［11］。不過也有研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血中HBV DNA載量與PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平無(wú)明確關(guān)系［12］。因此，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平與HBV DNA載量間關(guān)系仍不清楚，還需多中心、大樣本等研究以明確。

本研究結(jié)果表明，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4高表達(dá)，說明其水平與肝組織炎癥發(fā)生及程度有密切關(guān)系。CHB的炎癥發(fā)生是向肝硬化發(fā)展的一個(gè)中間過程，也誘導(dǎo)Tim-3及TLR-4等大量促炎性因子高表達(dá)，促進(jìn)和加重了肝組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此認(rèn)為，PBMCs表面是Tim-3及TLR-4的常見表達(dá)位置，在白細(xì)胞的中性粒細(xì)胞表面不表達(dá)或低水平表達(dá)，提示靶細(xì)胞免疫損失主要是通過PBMCs表面的Tim-3及TLR-4來(lái) 完 成 的，在CHB中發(fā)揮通過抑制過度免疫反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)肝損傷和抑制宿主細(xì)胞對(duì)HBV清除的雙重作用，通過HBV感染后炎癥反應(yīng)的發(fā)生和持續(xù)而導(dǎo)致慢性化，為此通過調(diào)節(jié)Tim-3及TLR-4表達(dá)水平可能會(huì)對(duì)CHB患者炎癥反應(yīng)的發(fā)生及肝纖維化形成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

本研 究結(jié) 果 顯示，Tim-3、TLR-4在CHB患者PBMCs表面的表達(dá)水平較健康組明顯升高，并隨CHB病情程度加重而逐漸高表達(dá)，Tim-3及TLR-4表達(dá)水平與CHB患者病情程度呈正相關(guān)，提示PBMCs表面Tim-3及TLR-4水平表達(dá)與機(jī)體感染HBV后的炎癥發(fā)生關(guān)系密切，可以反映肝組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生與病情程度，與趙小瑜等［10］的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平間正相關(guān)，提示同為負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子的Tim-3與TLR-4間具有明顯的協(xié)同作用，可協(xié)同參與CHB患者肝組織炎癥的免疫損傷過程。同時(shí)在CHB的急性肝損傷時(shí)，TLR-4還可通過識(shí)別HBV產(chǎn)生免疫反應(yīng)介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，另外，在CHB慢性炎癥時(shí)TLR-4還可能通過識(shí)別LSP介導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷，提示通過病毒識(shí)別并不是致肝細(xì)胞損失的惟一路徑。

有研究結(jié)果顯示，隨著CHB病情程度加重，患者腸道菌群紊亂明顯，厭氧菌減少而腸桿菌過度生長(zhǎng)，并移行入血，致大量LPS產(chǎn)生，而LPS正是TLR-4的配體，在與其結(jié)合后使TLR-4信號(hào)通路活化，促進(jìn)TNF-α等炎性因子水平高表達(dá)，致巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞趨化入肝臟，誘導(dǎo)和促進(jìn)了肝細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平表達(dá)與肝臟炎性指標(biāo)均呈正相關(guān)系（P＜0.05），其中Tim-3水平與炎性指標(biāo)相關(guān)性更強(qiáng)，與魏卓等［13］研究結(jié)果相一致，提示Tim-3與TLR-4可作為肝組織炎癥程度的評(píng)估指標(biāo)之一。

綜上所述，CHB患者PBMCs表面Tim-3、TLR-4水平升高，TIm-3、TLR-4表達(dá)呈正相關(guān)，二者與CHB患者病情及肝臟炎性程度相關(guān)。本研究?jī)H探討了CHB患者PBMCs表面表Tim-3、TLR-4水平變化，未做肝組織中Tim-3、TLR-4水平檢測(cè)及與肝纖維化程度的關(guān)系分析，也未分析CHB患者肝組織中Tim-3及TLR-4表達(dá)水平與循環(huán)血中Tim-3、TLR4水平關(guān)系。TLR-4受體作為引起CHB免疫損傷的靶點(diǎn)之一，適時(shí)沉默或上調(diào)TLR-4水平可能是CHB患者免疫治療的潛在發(fā)展方向。PBMCs表面Tim-3水平高表達(dá)后可下調(diào)免疫功能，誘導(dǎo)免疫耐受致CHB患者肝組織炎癥發(fā)生與慢性化，另外，在上調(diào)或沉默Tim-3水平后肝組織炎癥將如何變化？是否可通過調(diào)節(jié)Tim-3水平表達(dá)來(lái)治療CHB患者尚需進(jìn)一步研究。