王艷穎 宮蘋 張健

1.天津市口腔醫(yī)院（南開大學(xué)口腔醫(yī)院）種植科，天津300041；2.天津市口腔功能重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300041；3.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院種植科，成都610041

骨結(jié)合的種植體傳遞感覺的能力稱為骨感知[1]。牙種植體存在感覺功能，對(duì)此已達(dá)成共識(shí)[2]。然而，研究[3]證實(shí)種植體的觸覺功能與天然牙有所不同。臨床研究表明，與天然牙列的觸覺功能相比，種植體的主動(dòng)觸覺靈敏度閾值是天然牙的2~3倍[4]，而種植體的被動(dòng)觸覺靈敏度閾值是天然牙的50倍[5]。因此，提高種植體的感覺功能將有助于種植體在口腔內(nèi)最終實(shí)現(xiàn)生理性整合[6]。

天然牙的感覺主要來自于牙周膜的本體感受器，而種植體周圍并沒有類似天然牙牙周膜的這一特殊結(jié)構(gòu)。近年來的研究[7]證實(shí)，在種植術(shù)后新形成的骨組織內(nèi)可以檢測(cè)到神經(jīng)纖維，這些有髓和無髓神經(jīng)纖維分布在靠近種植體螺紋處的哈弗系統(tǒng)中。組織學(xué)研究[8]表明，種植體植入后種植體周圍的神經(jīng)纖維是以出芽生長(zhǎng)的方式進(jìn)行再生。周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)依賴于軸突的成功再生及雪旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）增殖所形成的微環(huán)境[9]。因此，在種植體周圍神經(jīng)再生的過程中，神經(jīng)元和SCs的生物學(xué)行為起著決定性的作用。

種植體的表面性質(zhì)是影響種植體周圍組織再生的重要因素。不同種植體表面的微結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分如何影響神經(jīng)元和SCs的生物學(xué)行為，如何影響外周神經(jīng)傳導(dǎo)，如何促進(jìn)種植體周圍的神經(jīng)再生，尤其是感覺神經(jīng)再生等，都成為種植體周圍神經(jīng)支配、感覺功能研究中亟待解決的問題。目前，不同表面處理的種植體，特別是化學(xué)改性表面對(duì)于SCs和神經(jīng)元的作用尚未明確。本課題擬探討不同種植體表面的微結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分對(duì)SCs生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，為進(jìn)一步提高種植體的感覺功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 不同種植體表面形態(tài)的體外檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)選用3種臨床常用的種植體表面，分別是光滑處理鈦表面（smooth polished，SMO）、大顆粒噴砂酸蝕鈦表面（sand-blasted，large grit，acidetched，SLA）、親水性化學(xué)活化大顆粒噴砂酸蝕鈦表面（chemically-modified SLA，modSLA）。鈦片直徑為15 mm，厚度為1 mm（Institute Straumann AG公司，瑞士）。利用掃描電子顯微鏡（scanning elec‐tron microscope，SEM）觀察3種鈦片的表面形態(tài)。

1.2 SCs的分離、培養(yǎng)、純化、鑒定

取材于出生1 d 的Sprague-Dawley 乳鼠，用顯微器械切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)并用磷酸緩沖鹽溶液清洗，在體視顯微鏡下剝離神經(jīng)外膜，剪成1 mm 的組織塊，依次用0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶消化。收集細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，吹打混勻細(xì)胞后，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。接種24 h 后換成含100 mg·L-1G418 的 DMEM 復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng) 3~4 d以除去成纖維細(xì)胞。采用S-100蛋白免疫組織化學(xué)法進(jìn)行鑒定。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用P2代SCs。

1.3 SCs在不同鈦片接種及實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)檢測(cè)方法，將SCs按所需的密度分別接種于3種鈦片表面。根據(jù)鈦片的種類不同，每種檢測(cè)均分為3組：SMO組、SLA組、modSLA組。

1.4 SCs的黏附和形態(tài)學(xué)觀察

SCs 按每孔2×104個(gè)接種于鈦片表面，鈦片置于24 孔板中，每組3 片。培養(yǎng)4 h 和24 h 后，從各組分別取出鈦片，經(jīng)2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金后在SEM 下觀察鈦片表面的細(xì)胞形態(tài)。

1.5 SCs的增殖活性檢測(cè)

SCs按每孔1×104個(gè)接種于鈦片表面，鈦片置于24孔板中，每組3片，分別在接種后的第1、3、5、7 天進(jìn)行 MTT 檢測(cè)。每孔加入 MTT （5 mg·mL-1），37 ℃避光孵育3.5 h 后終止。每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃避光孵育0.5 h。收集每孔樣本至96 孔板內(nèi)，在492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值。

1.6 SCs相關(guān)蛋白的表達(dá)

SCs 按每孔1×104個(gè)接種于鈦片表面，鈦片置于24 孔板中，每組3 片。在接種后的第3 天和第7天收集培養(yǎng)液，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic fac‐tor，BDNF） 含量。

1.7 SCs相關(guān)基因的表達(dá)

SCs 按每孔2×105個(gè)接種于鈦片表面，鈦片置于6 孔板中，每孔3 片相同鈦片。在接種后的第3天和第7 天提取細(xì)胞的總RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)NGF和BDNF mRNA表達(dá)水平的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次.所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和Tukey法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取P=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同處理鈦片的表面形態(tài)

3 種鈦片的大體觀見圖1，SEM 下觀見圖2。從圖中可見，SMO 鈦片表面有大量形狀不規(guī)則、深度較淺的凹陷；SLA 鈦片表面為多級(jí)孔狀結(jié)構(gòu)，孔洞形狀不規(guī)則，深淺不一；modSLA鈦片干燥后掃描電子顯微鏡圖與SLA鈦片一致。

圖 1 鈦片大體觀Fig 1 Gross view of titanium discs

圖 2 鈦片 SEM ×2 400Fig 2 Titanium discs SEM ×2 400

2.2 SCs的形態(tài)學(xué)觀察

純化后的P2代SCs呈梭形，兩端有細(xì)長(zhǎng)突起，少數(shù)呈三角形，有3個(gè)突起，細(xì)胞之間以針狀突起相互連接（圖3 左）。免疫熒光染色可見SCs 標(biāo)志蛋白S-100表達(dá)呈陽性（圖3右）。

SEM 顯示：接種4 h 后，SCs 在各組中黏附均較好，細(xì)胞伸出偽足，呈球形黏附在鈦片表面；接種24 h后，SCs伸展成典型的梭形或三角形，以細(xì)長(zhǎng)突起連接在鈦片表面。SCs 在3 種鈦片表面均良好黏附和伸展（圖4）。

2.3 SCs的增殖活性

各組不同培養(yǎng)時(shí)間下SCs 的增殖情況見圖5。從圖5 可見，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，各組OD 值均增大，說明SCs 在各組都可以良好的生長(zhǎng)和增殖。第1 天時(shí)，各組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第 3、5、7 天時(shí)，SMO 組的 OD 值均高于SLA 組和modSLA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第 3 天時(shí)，modSLA 組的 OD 值高于 SLA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；第5 天和第7天時(shí)，2 組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明，與SLA、modSLA 表面相比，SMO 表面對(duì)SCs增殖有明顯的促進(jìn)作用。

2.4 SCs相關(guān)蛋白的表達(dá)

各組不同培養(yǎng)時(shí)間下NGF 和BDNF 的表達(dá)見圖6。1）NGF的表達(dá)：第3天時(shí)，SLA組和modS‐LA 組高于 SMO 組 （P<0.05），modSLA 組高于SLA 組（P<0.05）；第7 天時(shí)，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。2） BDNF 的表達(dá)：第 3 天時(shí)，SLA 組和 modSLA 組高于 SMO 組 （P<0.05），modSLA 組 高 于 SLA 組 （P<0.05）； 第 7 天 時(shí) ，SLA 組和 modSLA 組低于 SMO 組 （P<0.05），SLA組和modSLA組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖 3 SCs 光鏡 ×100Fig 3 SCs light microscope ×100

圖 4 各組不同時(shí)間下的形態(tài)學(xué)觀察 SEM ×2 400Fig 4 Morphological observation of each group under different time SEM ×2 400

2.5 SCs相關(guān)基因的表達(dá)

各組不同培養(yǎng)時(shí)間下NGF 和BDNF mRNA 的表達(dá)見圖7。1）NGF mRNA 的表達(dá)基本與蛋白表達(dá)一致。第3 天時(shí)（圖7A），modSLA 組最高，約為SMO 組的1.8倍 （P<0.05），SLA 組約為SMO 組的 1.4 倍 （P<0.05），modSLA 組高于 SLA 組 （P<0.05）。第7天時(shí)（圖7B），各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2）BDNF mRNA的表達(dá)基本與蛋白表達(dá)一致。第3天時(shí)（圖7C），modSLA組最高，約為 SMO 組的 2 倍 （P<0.05），SLA 組約為 SMO組的1.7倍（P<0.05），modSLA組高于SLA組（P<0.05）。第7天時(shí)（圖7D），SLA組和modSLA組低于 SMO 組 （P<0.05），SLA 組和modSLA 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明，與SMO表面相比，modSLA、SLA表面可促進(jìn)SCs早期NGF和BDNF mRNA表達(dá)，其中modSLA表面的促進(jìn)作用更顯著。

3 討論

在牙科種植體中，純鈦材料的應(yīng)用最為廣泛。大顆粒噴砂酸蝕是目前鈦種植體表面粗糙處理的常用方法。在此基礎(chǔ)上經(jīng)過化學(xué)改性，進(jìn)而形成親水性的化學(xué)活化大顆粒噴砂酸蝕表面。親水性表面處理不會(huì)形成氧化鈦膜，具有較高的表面自由能和潤(rùn)濕性，同時(shí)避免了碳?xì)浠衔锏奈廴綶10-11]。研究[12-13]證實(shí)，親水性表面可以加快血液吸附，吸引骨結(jié)合相關(guān)蛋白至微孔結(jié)構(gòu)，加快間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于親水性表面的研究大多集中在成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等成骨相關(guān)細(xì)胞[14-15]。然而，親水性表面對(duì)于SCs和神經(jīng)元的作用尚未明確。

圖 5 各組不同時(shí)間下SCs的增殖情況Fig 5 Cell proliferation of SCs of each group under different time

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 種不同表面處理的種植體對(duì)于SCs 的黏附和伸展無明顯的影響；但是，3 種表面對(duì)SCs增殖、早期基因和蛋白表達(dá)的影響明顯不同。與SLA 和modSLA 表面相比，SMO 表面對(duì)于SCs增殖有明顯促進(jìn)作用。此結(jié)果表明，對(duì)于純鈦材料而言，光滑表面比粗糙表面更利于SCs的增殖。而在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neuronotrophic factors，NTFs） 分 泌 方 面 ， 與 SMO 和 SLA 表 面 相 比 ，modSLA 表面更促進(jìn) SCs 早期分泌 NGF 和 BDNF，以及早期NGF 和BDNF 的基因表達(dá)。由此可以推斷，親水性表面比非親水性表面更利于早期NTFs的蛋白分泌和基因表達(dá)。這可能是因?yàn)榇罅康难宓鞍讜?huì)吸附到親水性表面，對(duì)SCs的分泌功能起刺激作用，然而具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。NGF 和 BDNF 是 SCs 分泌的 2 種重要 NTFs。研究表明，NGF 在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)感覺神經(jīng)元的存活和軸突生長(zhǎng)[16]，而內(nèi)源性BDNF是周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生和髓鞘再生所必需的生長(zhǎng)因子[17]。

學(xué)者[18]探討了SCs 在機(jī)械加工、SLA、羥磷灰石涂層（hydroxyapatite-coated，HA）和鈦漿噴涂4 種鈦片表面的生長(zhǎng)增殖及相關(guān)蛋白和基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HA 涂層對(duì)于SCs 生物學(xué)功能的促進(jìn)作用最顯著，認(rèn)為可能與HA 涂層對(duì)蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附特性有關(guān)。關(guān)于神經(jīng)元方面的研究，學(xué)者[19]在不同鈦片上培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞，認(rèn)為與機(jī)械加工和SLA 表面相比，電解刻蝕表面更有利于大鼠背根神經(jīng)元細(xì)胞的黏附、細(xì)胞間的接觸以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成。另有學(xué)者[20]將胚胎大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞接種于氧化鈦表面，并以玻璃爬片作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化在2組并無顯著差異，但是，神經(jīng)突的延長(zhǎng)在氧化鈦表面受到了明顯的抑制，樹突比軸突的抑制結(jié)果更明顯。不同種植體表面對(duì)SCs和神經(jīng)元生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制仍有待明確。

圖 6 各組不同時(shí)間下NGF和BDNF的表達(dá)Fig 6 Expression of NGF and BDNF of each group under different time

Wada 等[8]研究表明，種植體周圍再生的神經(jīng)末梢數(shù)量在種植體植入后的第1周內(nèi)逐漸增加。本課題前期動(dòng)物體內(nèi)研究[21]也發(fā)現(xiàn)，大鼠股骨種植體周圍神經(jīng)纖維數(shù)量增加主要發(fā)生在種植體植入后的早期，同時(shí)這些神經(jīng)纖維具有周圍神經(jīng)纖維的典型結(jié)構(gòu)，即神經(jīng)軸突外有SCs完全包繞或者不完全包繞。這些組織學(xué)研究結(jié)果提示，種植體植入后的早期是種植體周圍神經(jīng)再生的關(guān)鍵時(shí)期。研究不同因素，如種植體的表面處理、負(fù)載情況、種植時(shí)機(jī)等，對(duì)種植體周圍神經(jīng)再生和外周神經(jīng)傳導(dǎo)的影響，都應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這一關(guān)鍵時(shí)期[22-24]。此外，神經(jīng)軸突再生和SCs的生物學(xué)功能在種植體周圍神經(jīng)再生過程中的作用不可替代，仍需進(jìn)一步深入研究。

圖 7 各組不同時(shí)間下NGF和BDNF mRNA的表達(dá)Fig 7 Expression of NGF and BDNF mRNA of each group under different time

綜上，本研究表明，SCs 在3 種不同種植體表面都能良好地黏附、伸展、增殖、表達(dá)相關(guān)蛋白和基因。其中，SMO 表面對(duì)于SCs 增殖有明顯促進(jìn)作用，而modSLA 表面對(duì)于SCs 早期NGF 和BDNF的分泌及基因表達(dá)有明顯促進(jìn)作用。本研究證實(shí)了不同種植體表面性質(zhì)對(duì)SCs的生物學(xué)行為影響具有差異。本研究為不同種植體表面性質(zhì)對(duì)種植體周圍神經(jīng)再生和外周神經(jīng)傳導(dǎo)影響的體內(nèi)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。