田晴 王瑩瑩 李強(qiáng) 陳棟

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省口腔醫(yī)院口腔科，鄭州450052；2.徐州市中心醫(yī)院口腔科，徐州221009

遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育異常是牙本質(zhì)礦化及結(jié)構(gòu)異常的一類常染色體顯性遺傳病。不同于以往的Shield 關(guān)于牙本質(zhì)發(fā)育異常的分類[1]，目前學(xué)者[2]更傾向?qū)⑵浞譃檠辣举|(zhì)發(fā)育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI）和根部牙本質(zhì)發(fā)育不良（radic‐ulardentin dysplasia）即牙本質(zhì)發(fā)育不良Ⅰ型（den‐tin dysplasia-Ⅰ，DD-Ⅰ）兩類。DD-Ⅰ是一種牙冠形態(tài)大致正常而牙根畸形導(dǎo)致青少年時期牙齒自發(fā)脫落的常染色體顯性遺傳病，該病具有遺傳異質(zhì)性[3]。目前已報道的致病基因有SMOC2、SSUH2 和VPS4B[4-6]。本課題小組在豫北地區(qū)發(fā)現(xiàn)一個致病基因?yàn)閂PS4B的DD-Ⅰ家系[6]。

在牙冠即將發(fā)育完成時，牙根開始形成。此時在頸環(huán)處由內(nèi)外釉上皮細(xì)胞增生形成不含星網(wǎng)狀層和中間層細(xì)胞的雙層上皮結(jié)構(gòu)，即上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath，HERS）[7]。HERS是牙根發(fā)育的啟動中心，在牙根發(fā)育中發(fā)揮重要作用[8-9]。其可誘導(dǎo)內(nèi)側(cè)的牙乳頭細(xì)胞分化為牙本質(zhì)細(xì)胞，生成根部牙本質(zhì)。根部牙本質(zhì)形成時，HERS 發(fā)生斷裂，外側(cè)的牙囊細(xì)胞與牙本質(zhì)接觸，分化成牙骨質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而形成根部牙骨質(zhì)。細(xì)胞角蛋白14（cytokeratin 14，CK14）是一種具有很強(qiáng)特異性的牙源性上皮標(biāo)記蛋白[9]，常用來標(biāo)記釉質(zhì)上皮。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nucle‐ar antigen，PCNA）在DNA 復(fù)制中必不可少，可表達(dá)于細(xì)胞周期的各個階段，通過監(jiān)測PCNA 細(xì)胞核陽性表達(dá)的高低可觀察細(xì)胞增殖活性強(qiáng)弱[10]。VPS4B 是一種多功能蛋白，可降解溶酶體、轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)蛋白和病毒出芽。HERS的形態(tài)、增殖及凋亡對牙根的發(fā)育至關(guān)重要。本研究擬通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)來檢測正常小鼠和Vps4b基因敲除小鼠磨牙牙胚中的HERS 形態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)CK14 和PCNA 的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討Vps4b 基因突變對牙根發(fā)育異常的可能影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑、設(shè)備

野生型C57BL/6J 體系小鼠（濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司），Vps4b 基因敲除鼠（南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院）。KAPA 快速DNA 提取試劑盒（北京普凱瑞生物科技有限公司），Taq 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒、寡核苷酸引物（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），PCR 擴(kuò)增儀（Eppendorf 公司，德國），CK14 抗體和PCNA 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的制備 在同一時刻將基因敲除雄鼠與正常雌鼠以1∶2 的比例交配，新生小鼠出生當(dāng)天中午計作出生后（postnatal，P）0.5 d，用無菌剪刀剪下2~3 mm 出生后新生小鼠鼠尾，置于1.5 mL離心管，待進(jìn)行基因型鑒定，剪取時注意避免交叉污染。斷頸法處死出生后5 d（P5 d）、9 d（P9 d）、11 d（P11 d）、15 d（P15 d）以及19 d（P19 d）的新生鼠，使用眼科剪和眼科鑷分離雙側(cè)下頜骨組織，4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液脫鈣3~6 d，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，制備5μm的連續(xù)切片。

1.2.2 基因型的鑒定 剪碎新生小鼠尾巴，置于1.5 mL 離心管內(nèi)，提取小鼠基因組DNA（genom‐ic DNA，gDNA）。采用25 μL PCR 反應(yīng)體系，根據(jù)使用說明，待測gDNA 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，引物 1 μL，dNTP 0.5 μL，10×Taq 緩沖液2.5 μL，ddH2O 20 μL 混勻后離心數(shù)秒，放入 PCR儀擴(kuò)增。設(shè)計2 種Vps4b gDNA 基因型鑒定引物，見表1。PCR 反應(yīng)程序：Vps4b-1 進(jìn)行94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；Vps4b-2進(jìn)行95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃30 s， 循 環(huán) 20 次 ， 然 后 95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 20 次，72 ℃延伸 10 min，16 ℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 取P5 d、P9 d、P11 d、P15 d、P19 d新生鼠的雙側(cè)下頜骨組織，通過蘇木精-伊紅（hemotoxylin and eosin，HE）染色確定不同時期小鼠下頜第一磨牙牙胚的切片，再使用免疫組織化學(xué)法染色。切片脫蠟，乙醇溶液梯度復(fù)水，微波爐中蒸煮pH 6.0 的檸檬酸抗原修復(fù)液至沸騰后放入切片90 s，PBS 沖洗5 min×3 次；在切片組織上避光滴加3%H2O2，靜置30 min，蓋上蓋子，PBS 沖洗5 min×3 次；滴加適量10%兔血清，室溫封閉1 h；分別滴加1∶100 稀釋的CK，1∶200 稀釋的PCNA，封盒，4 ℃冰箱內(nèi)過夜保存；PBS沖洗5 min×2次，滴加二抗，37 ℃濕盒內(nèi)靜置30 min；PBS 沖洗 5 min×2 次，滴加辣根過氧化物酶，37 ℃下放置30 min；滴加DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇溶液脫水，二甲苯溶液（Ⅰ）、二甲苯溶液（Ⅱ）中透明，滴加中性樹膠封固，觀察切片并拍照。

1.2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 在100 倍下觀察染色情況，顏色明顯高于背景的記為強(qiáng)陽性，高于背景的記為陽性，略高于背景的記為弱陽性，CK14 陽性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，PCNA 陽性物質(zhì)位于細(xì)胞核內(nèi)。CK14 胞質(zhì)棕紅色為陽性表達(dá)，藍(lán)色為陰性表達(dá)；PCNA胞核棕褐色或棕黃色為陽性表達(dá)，藍(lán)色為陰性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

PCR 結(jié)果顯示，F(xiàn)1/R1 作為引物，擴(kuò)增出2 種條帶，一種1 383 bp 條帶，一種384 bp 條帶（圖1左）；F2/R2 作為引物，擴(kuò)增出一種425 bp 條帶（圖1右）。這表明，新生小鼠中存在雜合型和野生型，不存在純合突變型。

圖 1 小鼠Vps4b gDNA擴(kuò)增Fig 1 Amplification of Vps4b gDNA

2.2 不同發(fā)育時期HERS形態(tài)

CK14 抗體免疫組織化學(xué)可以觀察到：正常小鼠P5 d 開始形成HERS，并向未來根尖方向生長；P9 d 開始出現(xiàn)根分叉結(jié)構(gòu)，此時HERS 結(jié)構(gòu)連續(xù)，外層為矩形細(xì)胞，內(nèi)層為立方狀細(xì)胞；到P11 d，一小部分HERS 結(jié)構(gòu)開始發(fā)生斷裂，HERS 細(xì)胞在牙根面呈簇狀聚集；在P15 d，HERS 結(jié)構(gòu)斷裂，僅末端部分完整，此時牙根的1/3 已形成；P19 d牙根基本達(dá)到生理性發(fā)育的長度，HERS末端結(jié)構(gòu)仍完整，斷裂HERS 細(xì)胞緊貼牙根面（圖2 上）。Vps4b 基因敲除小鼠同樣于P5 d 形成HERS 結(jié)構(gòu)；然而在P9 d，HERS 就開始斷裂；在P11 d 到P15 d根尖HERS 結(jié)構(gòu)完整，頸部呈不規(guī)則細(xì)胞簇；在P19 d 牙根表面僅存少量HERS 碎片，且根尖的發(fā)育不成熟（圖2下）。

2.3 PCNA的表達(dá)分布

PCNA 免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖3。P5 d，PC‐NA 在正常小鼠頸部冠邊緣附近的成釉細(xì)胞和HERS細(xì)胞中強(qiáng)陽性表達(dá)，牙囊細(xì)胞和牙乳頭細(xì)胞中陽性表達(dá)；在Vps4b 基因敲除小鼠成釉細(xì)胞、HERS細(xì)胞、牙囊細(xì)胞及牙乳頭細(xì)胞陽性表達(dá)，但強(qiáng)度降低。P9 d，PCNA 在正常小鼠牙乳頭細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，成釉細(xì)胞、HERS細(xì)胞和牙囊細(xì)胞中陽性表達(dá)；在Vps4b基因敲除小鼠牙乳頭細(xì)胞呈陽性表達(dá)，成釉細(xì)胞、HERS 細(xì)胞弱陽性表達(dá)。P11 d，PCNA 在正常小鼠牙乳頭細(xì)胞呈陽性表達(dá)，成釉細(xì)胞、HERS 細(xì)胞和牙囊細(xì)胞中弱陽性表達(dá)；在Vps4b基因敲除小鼠牙根表面HERS 細(xì)胞中弱陽性表達(dá)，在牙乳頭細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)。P15 d，PCNA在正常小鼠牙乳頭細(xì)胞陽性表達(dá)，牙囊細(xì)胞弱陽性表達(dá)，牙根表面HERS 細(xì)胞中弱陽性表達(dá)；在Vps4b基因敲除小鼠牙囊細(xì)胞及牙乳頭細(xì)胞陽性表達(dá)，HERS細(xì)胞中弱陽性表達(dá)。P19 d，PCNA僅在正常小鼠牙根末端HERS細(xì)胞中陽性表達(dá)、牙乳頭細(xì)胞和牙囊細(xì)胞中弱陽性表達(dá)；在Vps4b基因敲除小鼠HERS細(xì)胞弱陽性表達(dá)，牙囊細(xì)胞及牙乳頭細(xì)胞中無表達(dá)。

圖 2 CK14免疫組織化學(xué)結(jié)果 ×100Fig 2 Immunohistochemical results of cytokeratin 14 ×100

圖 3 PCNA免疫組織化學(xué)結(jié)果 ×100Fig 3 Immunohistochemical results of PCNA ×100

3 討論

條件性基因敲除技術(shù)是研究基因的一種重要方法。本研究中的Vps4b 基因敲除小鼠是通過CRISPR-Cas9技術(shù)獲得的[11]，均為雜合子，理論上子代小鼠有Vps4b+/+、Vps4b+/-、Vps4b-/-3 種類型。本研究中PCR 擴(kuò)增顯示子代小鼠中不存在Vps4b-/-純合子，說明Vps4b基因在胚胎發(fā)育過程中起重要作用，且已有研究[12]表明Vps4b基因敲除小鼠純合突變在胚胎早期發(fā)育階段致死。VPS4B 基因通過Wnt-β-catenin 信號通路調(diào)節(jié)人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的增殖、遷移和向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，在hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中存在高度表達(dá)的VPS4B 蛋白。這表明Vps4b基因在牙齒發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

正常牙根的發(fā)育與HERS密切相關(guān)，首先需要形成完整的HERS，繼而HERS 在特定的時期斷裂，同時HERS細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)中正常小鼠P11 d HERS 開始發(fā)生斷裂，而Vps4b 基因敲除小鼠HERS 在P9 d 就開始斷裂，最終牙根發(fā)育不完整，提示Vps4b 基因?qū)ρ栏陌l(fā)育有一定的影響。本研究利用PCNA 監(jiān)測HERS細(xì)胞及其周圍細(xì)胞的增殖活性，發(fā)現(xiàn) P5 d 到 P19 d，PCNA 在 HERS 末端始終陽性表達(dá)，表明HERS細(xì)胞增殖在牙根生長發(fā)育中的潛在重要作用。與正常小鼠相比，Vps4b基因敲除小鼠P9 d 時HERS 結(jié)構(gòu)就開始斷裂，PC‐NA 在HERS 細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，P19 d 時PCNA 僅在HERS 細(xì)胞中弱陽性表達(dá)，因此本研究推測Vps4b 基因可能通過降低HERS 細(xì)胞及牙乳頭細(xì)胞的增殖活性，影響HERS斷裂的時間以及成牙本質(zhì)細(xì)胞的形成，進(jìn)而導(dǎo)致牙本質(zhì)形成異常。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法，觀察到不同時期HERS 的形態(tài)變化以及PCNA 在Vps4b 基因敲除小鼠HERS中的表達(dá)改變，進(jìn)一步推測Vps4b 基因突變導(dǎo)致HERS細(xì)胞增殖發(fā)生改變，最終引起牙根發(fā)育異常。VPS4B 基因可通過MAPK 通路調(diào)控細(xì)胞的數(shù)量變化[13]，本研究猜測Vps4b基因可能也通過MAPK通路調(diào)控HERS細(xì)胞的增殖凋亡。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。