靳曉蘭 張亞男 孫成蕊 鄒朝暉

1.天津市津南醫(yī)院口腔科，天津300350；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，天津300192；3.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科三室，天津300070

牙周炎為慢性破壞性疾病，長期慢性炎性因子浸潤導(dǎo)致牙周膜細胞的損傷和凋亡，使得牙周膠原纖維破壞，嚴重的炎癥反應(yīng)會造成不可逆的牙周損傷導(dǎo)致牙齦萎縮甚至是牙齦壞死。研究[1-2]顯示人牙周膜成纖維細胞（human periodontal liga‐ment fibroblasts，hPDLFs）在牙周炎受損、牙周組織功能維持和修復(fù)中發(fā)揮著極其重要的作用，有效阻斷牙周炎過程中hPDLFs 的損傷對促進牙周組織修復(fù)有著重要意義。低能量激光照射（low-lev‐el laser irradiation，LLLI）指的是輸出功率在500 mW內(nèi)，能量密度范圍0.04~50 J·cm-2，波長范圍600~1 100 nm的近紅外或紅色光激光[3]。LLLI是近年來臨床上常用的理療方法，其在治療神經(jīng)性和糖尿病潰瘍疾病方面以及促進骨組織和軟組織的愈合方面均有較好的作用，其在治療牙周疾病及牙周炎方面亦有顯著療效[4-6]。目前有報道[7]顯示LLLT可能通過調(diào)節(jié)腺苷-3’,5’-環(huán)化一磷酸（cyclic ade‐nosine monophosphate， cAMP） /核 轉(zhuǎn) 錄 因 子 -κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的人牙周膜細胞炎癥反應(yīng)，但是關(guān)于LLLI 對hPDLFs 炎性損傷的影響和作用有待進一步研究，本研究擬探討LLLI對LPS介導(dǎo)hPDLFs炎性損傷的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

hPDLFs（上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號：2630）。HRP 標記的山羊抗兔多克隆抗體、HRP 標記的山羊抗兔多克隆抗體、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli） LPS、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-3、MMP-9、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（Sigma公司，美國），白細胞介素（interleukin，IL）-8酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA 試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），Trizol試劑盒、CCK8細胞增殖檢測試劑盒、Hoechst 染色試劑盒、Western blot 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），相關(guān)引物合成（北京賽百勝生物技術(shù)公司），DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司，美國），CO2培養(yǎng)箱 （Thermo Scientific Forma 公司，美國），酶標儀（Bio-Rad公司，美國），F(xiàn)luo-8/AM（Invitrogen 公司，美國），Insight-PlusIQ 型激光共聚焦顯微鏡（Meridian 公司，美國），熒光相差顯微鏡（北京榮興光恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLFs 的培養(yǎng) hPDLFs 復(fù)蘇后以 10% FBS的低糖DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d 換液，于熒光相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況，待細胞處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.2.2 分組 將hPDLFs接種于5個不同培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，隨機分為正常組、LPS 組、LPS+LLLI 組。正常組細胞行常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS 組和LPS+LLLI組在加入含1 mg·L-1濃度的LPS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，LPS 組繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)及換液，LPS+LLLI 組3 個亞組在常規(guī)培養(yǎng)及換液的基礎(chǔ)上分別接受2、4、6 J·cm-2的 LLLI。采 用 輸出 功 率 為 100 mW~12 W 半導(dǎo)體激光器，波長為980 nm。功率密度設(shè)置為141.5 mW·cm-2，第1 次激光照射，記為第0天，并于第0~3 天連續(xù)照射4 d，4 d 后行后繼檢測。照射時間（s）=能量密度（J·cm-2）/功率密度（W·cm-2）。2 J·cm-2組照射時間為 14.13 s，4 J·cm-2組照 射時 間為 28.27 s，6 J·cm-2組 照射 時間 為42.40 s。

1.2.3 CCK-8 測定細胞活力值 LLLI 處理后，將5組細胞取出以測定每個組hPDLFs 的細胞增殖活力。使用PBS 清洗hPDLFs 2 次后，采用完全培養(yǎng)液重懸細胞，以密度為每孔1×104個接種于96 孔板。隨后向其中加10 μL CCK8試劑，37 ℃下孵育2 h，酶標儀上測定450 nm 波長下的光密度（opti‐caldensity，OD）值，細胞存活率=（OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.2.4 細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測定 LLLI 處理后，將 5 組 hPDLFs 經(jīng) PBS 沖洗 2 次，于 37 ℃條件下用終濃度為 10 μmol·L-1Fluo-8/AM 培養(yǎng)箱中孵育細胞45 min，無鈣PSS 溶液清洗2 遍，將蓋玻片倒置密封小室上，并向小室中加入500 μL 生理鹽液，經(jīng)過488 nm 的氫激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，通過Insight-PlusIQ 型激光共聚焦顯微鏡對熒光強度行測定。細胞內(nèi) Ca2+濃度=Kd[（F-Fmin）/（Fmax-F）]，式中Kd為400 nmol·L-1；F為所測到的相對熒光值；Fmax為加入10 μmol·L-1的高鈣液后所得最大熒光值；Fmin為加入 10 μmol·L-1無鈣液后所得最小熒光值。

1.2.5 Hoechst染色檢測細胞凋亡率 LLLI處理后，將5組hPDLFs經(jīng)PBS洗2次，經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗后，每孔加入0.5 mL 的Hoechst染色液，于溫箱中37 ℃下孵育30 min，PBS 洗去染料后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照，隨機取5個視野，正常細胞核染成均勻藍色，凋亡細胞胞核碎裂濃縮，呈現(xiàn)明亮藍色，計算細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 測定細胞上清液炎性因子 LLLI處理后，采用ELISA 法按說明書測定每個實驗組hP‐DLFs 細胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 炎性因子含量，經(jīng)離心取各組細胞上清液為樣品進行分析，按相應(yīng)的試劑盒說明書進行上清液中細胞因子的含量測定，利用酶標儀PR-521 讀取各樣品細胞OD 值，按照標準品濃度及對應(yīng)的OD 值建立標準曲線確定 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 炎性因子含量。

1.2.7 MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因表達 LLLI處理后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse tran‐scription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 測定5 個實驗組 hPDLFs 中 MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表達水平。加入TRIzol 試劑對各組細胞進行裂解后，提取hPDLFs的總RNA。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明書行相應(yīng)cDNA合成并進行擴增。擴增條件均為95 ℃預(yù)變性 1 min，95 ℃變性 30 s，59 ℃退火30 s，59 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。MMP-2 上游引物序列：5’-TGACTTTCTTGGATCGGGTCG-3’，下游引物序列：5’-AAGCACCACAGATGACTG-3’；MMP-3 上游引物序列：5’-AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT-3’，下游引物序列：5’-TCCCCGT‐CACCTCCAATCC-3’；MMP-9 上游引物序列：5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’，下游引物序列：5’-GGCAGGG ACAGTTGCTTCT-3’；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，下游引物序列：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。目的基因灰度值與GAP‐DH 灰度值的比值為MMP-2、MMP-3、MMP-9 mRNA的表達水平。

1.2.8 MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白表達 LLLI處理后，通過Western blot 測定5 個實驗組hPDLFs中MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白的相對表達水平。提取并定量測定hPDLFs 總蛋白，將變性后的蛋白進行電泳，電泳槽內(nèi)加入足量電泳液，40 V條件下電泳4~5 h，電泳后對其進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時長40 min，轉(zhuǎn)膜后用TBST 緩沖液反復(fù)沖洗，置于4 ℃條件下封閉12 h，向其中加入MMP-2、MMP-3、MMP-9 一抗（1∶1 000），加入一抗后進行振蕩使其充分接觸，振蕩時間為1 h，1 h后用上述同樣的沖洗方法沖洗后；加入HRP 標記的二抗（1︰1 500）后再次進行振蕩使其充分接觸，振蕩1 h并再次沖洗3 次，最后用DAB 顯色法顯影，拍攝X射線膠片，用Image J 圖像分析軟件對各組條帶行灰度值分析，以GAPDH 作為內(nèi)參。目的蛋白與內(nèi)參灰度比值為MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表達相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)用K-S 檢驗符合正態(tài)分布，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，兩兩比較應(yīng)用最小顯著差法（LSD 法）進行處理，P<0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLFs細胞培養(yǎng)

在細胞接種后24 h，顯微鏡下觀察可見大部分hPDLFs 貼壁，細胞呈長梭形或多角形，胞體較為豐滿，胞質(zhì)均勻，細胞兩端有較細長的突起，3 d換液一次，按1∶2 傳代，經(jīng)過幾次傳代，處于對數(shù)生長期的hPDLFs 生長較為旺盛，免疫熒光顯微鏡下hPDLFs 綠色熒光鑒定波形絲蛋白陽性，為中胚層來源的成纖維細胞（圖1左）。相差顯微鏡下觀察其排列形狀多為柵欄狀、漩渦狀或放射狀（圖1右）。

圖 1 hPDLFs的鑒定 ×200Fig 1 Identification of hPDLFs ×200

2.2 細胞存活率及細胞內(nèi)Ca2+濃度

與正常組比較，LPS 組hPDLFs 細胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加，細胞活力降低（P<0.05）。與LPS組比較，LPS+LLLI 組細胞內(nèi)游離Ca2+濃度降低，細胞活力升高（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI 對LPS誘導(dǎo)hPDLFs 炎性損傷有保護作用，降低細胞內(nèi)游離Ca2+濃度，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯（表1）。

表 1 細胞存活率及細胞內(nèi)Ca2+濃度Tab 1 Cell survival rate and intracellular calcium ion concentration

2.3 Hoechst染色凋亡率檢測

與正常組凋亡率（7.8%±2.6%）相比較，LPS組hPDLFs 細胞凋亡率（46.2%±6.4%）顯著增加（P<0.05）；與LPS 組相比較，LPS+LLLI 各亞組細胞凋亡率（2、4、6 J·cm-2組細胞凋亡率分別為39.7%±4.8%、 23.1%±3.1%、 31.8%±5.7%） 降 低（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI對LPS誘導(dǎo)hPDLFs炎性損傷有保護作用，減少細胞凋亡，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯（P<0.05）（圖2）。

圖 2 Hoechst染色檢測hPDLFs細胞凋亡率 熒光顯微鏡 ×200Fig 2 Detection of apoptosis rate of hPDLFs by Hoechst staining fluorescence microscope ×200

2.4 細胞上清液中炎性因子含量

采用ELISA 法測定各組細胞上清液炎性因子含量，與正常組比較，LPS 組細胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β 及IL-6 的含量顯著升高 （P<0.05）；與LPS 組相比較，LPS+LLLI 各亞組細胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β 及 IL-6 的含量顯著降低 （P<0.05），結(jié)果表明，LLLI 能夠降低hPDLFs 炎性損傷后細胞上清液中的炎性因子，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯（表2）。

2.5 MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表達水平

與正常組比較，LPS 組hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因的表達顯著升高（P<0.05）。與 LPS 組相比較，LPS+LLLI 各亞組 hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因的表達顯著降低（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI能夠降低hPDLFs炎性損傷后細胞MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表達水平，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯（P<0.05）（圖3）。

表 2 細胞上清液中炎性因子含量Tab 2 The content of inflammatory factors in cell su‐pernatant μg·L-1，

表 2 細胞上清液中炎性因子含量Tab 2 The content of inflammatory factors in cell su‐pernatant μg·L-1，

注：與正常組相比，#P<0.05；與LPS 組相比，*P<0.05；與4 J·cm-2組相比，@P<0.05。

IL-6 0.84±0.03*3.36±0.05#2.47±0.04#*@1.38±0.02#*2.35±0.03#*@組別正常組LPS組2 J·cm-2組4 J·cm-2組6 J·cm-2組TNF-α 0.79±0.14*5.27±0.08#3.92±0.05#*@2.82±0.02#*3.48±0.03#*@IL-8 0.92±0.02*6.38±0.06#5.06±0.07#*@3.56±0.04#*5.01±0.06#*@IL-1β 1.03±0.04*7.14±0.06#5.86±0.05#*@3.75±0.06#*5.64±0.03#*@

2.6 MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表達水平

與正常組比較，LPS 組hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白的表達顯著升高 （P<0.05）。與 LPS 組 相 比 較，LPS+LLLI 各亞 組 hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白的表達顯著降低（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI能夠降低hPDLFs炎性損傷后細胞MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白的表達，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯（P<0.05）（圖4）。

圖 3 MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表達Fig 3 MMP-2, MMP-3, MMP-9 gene expression

圖 4 MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表達Fig 4 MMP-2, MMP-3, MMP-9 protein expression

3 討論

慢性牙周炎是最常見的牙周病，其中牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）在牙周炎時損傷凋亡是該病理過程的重要重要環(huán)節(jié)，本研究使用LPS 刺激hPDLFs 可以模擬牙周炎癥反應(yīng)過程，LPS 選擇1 mg·L-1的濃度，參考國內(nèi)外參考文獻，和早前的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)該濃度正合適能夠引起中度的hPDLFs 炎性損傷，為后繼研究提供炎性損傷模型，雖然加大LPS 濃度，能夠顯著抑制hPDLFs 的存活，但是考慮臨床過程中慢性牙周炎是輕中度的長期炎性刺激，故1 mg·L-1的濃度既能導(dǎo)致細胞炎癥，也沒有造成細胞大量死亡，是一個合理的誘導(dǎo)劑量，但該濃度仍較參考文獻濃度低，考慮與本研究hPDLFs 實驗前液氮存儲凍存復(fù)蘇后進行LPS 誘導(dǎo)有關(guān)，凍存復(fù)蘇對細胞的狀態(tài)有影響所致，hPDLFs 細胞對LPS 誘導(dǎo)損傷敏感性升高[7-9]。結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)能夠顯著上調(diào)hP‐DLFs 細胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 及 IL-6 的含量，hPDLFs 細胞增殖率降低，凋亡增加，細胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加，表明該牙周炎體外細胞模型成功。在此過程中 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 等炎性因子浸潤導(dǎo)致牙周組織細胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)中MMP-2、MMP-3、MMP-9的高表達，MMPs是一類含Zn2+的中性蛋白水解酶，能降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），MMPs高表達在牙周炎牙周組織破壞中起著尤為重要的作用[10-12]，本研究LPS 介導(dǎo)炎性損傷后，hP‐DLFs 細胞 MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因和蛋白表達顯著升高印證了這一點。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)LLLI 處理后，LPS 介導(dǎo)的hPDLFs 增殖活性上升且細胞凋亡率下降，細胞內(nèi)游離Ca2+濃度亦顯著降低；據(jù)此可知，LLLI 可以顯著緩解LPS 引起的hPDLFs 炎性損傷。進一步采用ELISA 法測定，與LPS 組比較，LPS+LLLI 組細胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 及 IL-6 的含量顯著降低，表明LLLI 對LPS 誘導(dǎo)hPDLFs 炎性損傷有保護作用，LLLI 能夠降低hPDLFs 炎性損傷后細胞上清液中的炎性因子，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯。有研究[12-14]表明，牙周炎患者齦溝液中MMP-2、MMP-3 和MMP-9 的活性增高。此外，隨著牙齦炎癥程度的增加，MMP 活性和表達也增加，因此，MMP 途徑可能是牙周組織破壞的關(guān)鍵途徑，降低其表達意義重大。本研究中LLLI 對LPS 誘導(dǎo)hPDLFs 炎性損傷后細胞MMP-2、MMP-3 和MMP-9 的表達檢測顯示，與LPS 組相比，LPS+LLLI 各亞組 MMP-2、MMP-3 和 MMP-9 顯著降低，照射強度為4 J·cm-2時效果最明顯，起到了阻斷MMP途徑的作用。

綜上所述，經(jīng)過LLLI 處理后可顯著改善LPS誘導(dǎo)的hPDLFs 炎性損傷。推測LLLI 可能是通過降低細胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 的含量進而降低hPDLFs 炎性損傷后細胞MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達水平來發(fā)揮抗炎作用，本研究結(jié)果可為臨床上采用LLLI 治療牙周炎提供理論依據(jù)和借鑒。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。