吳言輝 許輝 姚清婷 劉少華 艾皮孜古麗·亞庫(kù)普 路利丹 石亮

1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔頜面外科，烏魯木齊830001；3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院口腔頜面外科，濟(jì)南250012；4.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南250012

放射損傷造成的口腔干燥癥是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌放療后最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1]。電離輻射損傷涎腺導(dǎo)致分泌功能降低可伴發(fā)猖獗齲、吞咽及語(yǔ)言功能障礙等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。因此，對(duì)電離輻射涎腺損傷機(jī)制更好地了解可為防治唾液腺分泌功能異常提供新的思路。下頜下腺唾液分泌量占口腔靜息分泌總量的60%~65%，對(duì)維持口腔濕潤(rùn)起重要作用。在生理狀態(tài)下毒蕈堿型乙酰膽堿受體（muscarinic acetylcholine receptor，M 受體）亞型M3 調(diào)控水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）介導(dǎo)的涎腺跨細(xì)胞分泌與claudin-4 介導(dǎo)的涎腺旁細(xì)胞分泌途徑是下頜下腺水和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的兩種重要方式[2]。通常緊密連接（tightjunction，TJ）為維持唾液腺上皮的極性、建立正常的跨上皮細(xì)胞離子梯度提供了重要保障，是水、離子和小分子物質(zhì)經(jīng)過(guò)旁細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和限制因素。電離輻射損傷后AQP5介導(dǎo)的涎腺跨細(xì)胞分泌途徑損傷可能參與唾液腺分泌功能低下[3-4]。但是目前關(guān)于放射損傷對(duì)TJ 超微結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的旁細(xì)胞分泌途徑影響如何，以及在旁細(xì)胞途徑中對(duì)離子調(diào)控起主導(dǎo)作用的claudin-4 如何改變尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在建立大鼠下頜下腺放射損傷模型，探討電離輻射對(duì)下頜下腺TJ 超微結(jié)構(gòu)及claudin-4 的影響，為進(jìn)一步闡述電離輻射后唾液腺的損傷機(jī)制，防治唾液腺分泌功能異常提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

8 周齡健康雄性Wistar 大鼠24 只，體重250 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，研究經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：IACUC20190704-01）。

醫(yī)用直線加速器（Elekta公司，瑞典），ECLIPSE Ci-L951175 光學(xué)顯微鏡（Nikon 公司，日本），JEM-1230 透射電子顯微鏡（JEOL 公司，日本），IX71-12FL/PH 型熒光顯微鏡（OLYMPUS 公司，日本），M3 受體抗體（bs-1289R，1∶50）購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；AQP5抗體（178615，1∶50）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；claudin-4抗體（BS-1068，1∶50）購(gòu)于美國(guó)Bioworlde公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠下頜下腺放射損傷模型的建立 將Wi‐star大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和照射組，照射組又分為照射后1、4、12 周組，每組6 只。研究證實(shí)15 Gy以上劑量照射可以造成涎腺組織不可逆性損傷，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道一次性給予下頜下腺20 Gy照射。具體操作如下。大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，醫(yī)用直線加速器一次性給予右側(cè)下頜下腺區(qū)20 Gy 照射[6]（射線類型：電子線；能量：6 MeV；劑量率：4 Gy·min-1；中心皮距：100 cm）。照射前標(biāo)記照射區(qū)域（暴露區(qū)域：2.5 cm×2.0 cm），照射范圍包括全部的右側(cè)下頜下腺。其他部位由3 mm鉛板遮擋，避免射線影響。

1.2.2 腺體分泌量檢測(cè) 照射后1、4、12周，各組大鼠再次麻醉，于口底前部將直徑0.5 mm 的聚乙烯塑膠管插入右側(cè)下頜下腺導(dǎo)管內(nèi)，右側(cè)頰部制備隧道將聚乙烯塑膠管引出口外固定。待大鼠恢復(fù)意識(shí)2 h后，在插管當(dāng)日上午9~12時(shí)測(cè)量腺體的分泌量，采用Schirmer 實(shí)驗(yàn)，以5 min 內(nèi)濾紙條（35 mm×5 mm）濕潤(rùn)的長(zhǎng)度來(lái)表示分泌多少。測(cè)量結(jié)果重復(fù)2次，間隔10 min，取平均值[4]。

1.2.3 腺體組織的病理學(xué)觀察 游離摘除右側(cè)腺體，取部分組織10%中性甲醛固定，脫水、包埋、切片，厚5 μm，蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，封固。每組在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)鏡下視野，觀察腺體病理學(xué)變化，用圖像測(cè)量軟件Image J 1.46r計(jì)數(shù)腺泡細(xì)胞數(shù)目，取均值[4]。

1.2.4 透射電鏡觀察腺體TJ 超微結(jié)構(gòu) 取1 mm3組織，2.5%戊二醛固定、沖洗、1%鋨酸固定，脫水、包埋、切片，醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛染色，50 000 倍透射電鏡下觀察TJ 超微結(jié)構(gòu)變化，每組隨機(jī)選取10個(gè)鏡下視野測(cè)量寬度，取均值[7]。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)M3、AQP5、claudin-4 的分布取部分組織10%中性甲醛固定，脫水、包埋、切片，微波修復(fù)15 min，室溫30 min，M3、AQP5、claudin-4（1∶50） 4 ℃孵育過(guò)夜。Cy3-IgG （1∶100）37 ℃孵育1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole， DAPI） 孵 育 5 min，核染，封片，熒光顯微鏡下觀察分布變化，M3、AQP5 每例隨機(jī)選取10 個(gè)不同腺泡細(xì)胞，每組6例，定量計(jì)算熒光強(qiáng)度，取均值（claudin-4 選取導(dǎo)管細(xì)胞）[8]。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)M3、AQP5、claudin-4的表達(dá) 取冰凍組織，裂解離心，BCA法測(cè)蛋白濃度。40 μg總蛋白12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate poly‐acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene difuoride，PVDF）200 mA下M3 120 min，AQP5、claudin-4 70 min，β-actin 90 min。5%脫脂奶粉TBST（Tris-base，NaCl，冰醋酸，吐溫20） 室溫2 h，M3、AQP5（1∶1 000），claudin-4（1∶800），β-actin（1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）二抗（1∶50 000）孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光劑發(fā)光并觀察檢測(cè)結(jié)果，采用BandScan分析膠片的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用 GraphPad Prism 8.0 及 IBM SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用K-S檢驗(yàn)證實(shí)數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，Levene 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。整體比較采用單因素方差分析，組間兩兩多重比較采用LSD 法，各照射組與對(duì)照組進(jìn)行比較后，照射組組間再進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分泌量變化

Schirmer 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組及照射后1、4、12 周唾液分泌量分別為 （2.09±0.05）、（1.51±0.05）、（1.46±0.04）、（1.19±0.05）mm，照射側(cè)腺體分泌量在1、4、12 周較對(duì)照組明顯降低（P<0.01）；4周較1周降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；12周較1、4周時(shí)分泌量明顯降低（P<0.01）。

2.2 病理學(xué)變化

對(duì)照組腺體組織光鏡下可觀察到清晰的腺泡和導(dǎo)管結(jié)構(gòu)；照射后1周可見(jiàn)腺體間質(zhì)淤血水腫，局灶腺上皮細(xì)胞胞漿空泡變，少數(shù)細(xì)胞核核固縮、深染，查見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；照射后4周仍可見(jiàn)間質(zhì)水腫、空泡變、核固縮、核深染，查見(jiàn)小灶腺體壞死伴少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；照射后12 周間質(zhì)淤血水腫減輕，仍可見(jiàn)細(xì)胞胞漿空泡變，部分腺上皮細(xì)胞核核固縮、深染，查見(jiàn)多處小灶性腺體壞死伴中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。經(jīng)腺泡細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)照組腺泡細(xì)胞為每視野（517.90±16.44）個(gè)，電離輻射后1、4、12 周照射組腺泡細(xì)胞數(shù)分別為（510.60±14.08）、（452.20±12.06）、（357.10±11.48） 個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，照射后1周腺泡細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），4、12周明顯小于對(duì)照組（P<0.01），12周較4周明顯減少（P<0.01）。

圖 1 下頜下腺電離輻射后的組織形態(tài)學(xué)變化 HE × 400Fig 1 The histomorphological changes of the submandibular glands after irradiation HE × 400

2.3 TJ超微結(jié)構(gòu)變化

對(duì)照組腺體相鄰腺泡上皮細(xì)胞間靠近腺泡腔的位置可觀察到基本完整、清晰的細(xì)胞間TJ 結(jié)構(gòu)（圖2）。與對(duì)照組相比：1 周TJ 結(jié)構(gòu)模糊、崩塌；4 周電子密度降低；12 周模糊、崩塌明顯（圖2）。對(duì)照組的TJ 寬度為（17.46±0.07）nm，電離輻射1、 4、 12 周 照 射 組 的 TJ 寬 度 分 別 為 （12.67±0.11）、（12.60±0.09）、（9.67±0.10）nm。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，照射后1、4、12 周的TJ 寬度明顯小于對(duì)照組（P<0.01），照射后4周與1周的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），照射后12 周顯著少于1、4 周（P<0.01）。

圖 2 電離輻射對(duì)下頜下腺TJ超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡 × 50 000Fig 2 Effects of radiation on TJ ultrastructure in submandibular glands transmission electron microscopy × 50 000

2.4 M3、AQP5及claudin-4分布變化

各組M3、AQP5 及claudin-4 的分布變化見(jiàn)圖3、4。對(duì)照組M3 彌散分布在腺泡細(xì)胞的胞漿和胞膜上，AQP5 主要分布在腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的頂、側(cè)膜上；照射后各時(shí)間點(diǎn)M3、AQP5 的熒光分布無(wú)明顯改變。但其熒光強(qiáng)度逐漸減弱（P<0.01），照射后4、12周較1周明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），12 周與4 周相比熒光強(qiáng)度減弱（P<0.05）。對(duì)照組claudin-4 主要分布在導(dǎo)管細(xì)胞的側(cè)膜和基底膜上。照射后各時(shí)間點(diǎn)claudin-4的熒光分布特性沒(méi)有明顯改變。但其熒光強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)（P<0.01），照射后4 周較1 周增加（P<0.05），12 周與1、4 周相比熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.5 M3、AQP5及claudin-4表達(dá)變化

Western blot 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，照射后1、4、12 周M3、AQP5 蛋白表達(dá)持續(xù)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），12周時(shí)蛋白表達(dá)量較1、4 周降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；而claudin-4 在照射后1、4、12 周蛋白水平顯著高于對(duì)照組，呈時(shí)間依賴性高表達(dá)（P<0.01），12 周時(shí)蛋白表達(dá)量較1、4 周增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

照射和炎癥可能導(dǎo)致腺泡細(xì)胞凋亡和/或功能障礙，造成組織損傷，唾液分泌能力降低，這可能是頭頸部癌癥放療患者以及自身免疫性疾病如干燥綜合征患者唾液腺分泌功能低下的主要原因[9-10]，其具體機(jī)制尚不清楚。TJ 廣泛存在于所有上皮或內(nèi)皮細(xì)胞間連接的最頂端，是物質(zhì)經(jīng)旁細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。TJ 在涎腺上皮構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)、可被調(diào)控的旁細(xì)胞屏障，其表達(dá)與分布的改變會(huì)引起通透性的變化，從而影響旁細(xì)胞途徑的水分泌。許多內(nèi)源或外源性刺激可通過(guò)激活某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于TJ，影響其結(jié)構(gòu)和功能，旁細(xì)胞途徑生理性屏障功能受損，通透性發(fā)生改變，誘發(fā)病理性損害。研究[8]證實(shí)激活M3受體介導(dǎo)TJ 的開放程度，可以調(diào)控唾液分泌。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立下頜下腺放射損傷模型，觀察腺體分泌功能、組織學(xué)變化、TJ超微結(jié)構(gòu)變化、M3受體、AQP5 及TJ 蛋白claudin-4 的表達(dá)分布改變。顯示電離輻射后早期TJ 寬度的減少，M3 受體與AQP5 蛋白下調(diào)，claudin-4 表達(dá)增多可能是下頜下腺放射損傷后唾液分泌功能減退的重要原因。

圖 3 下頜下腺電離輻射后M3、AQP5、claudin-4的分布改變 免疫熒光染色 × 400Fig 3 The changes of M3,AQP5 and claudin-4 on the distributions in submandibular glands after irradiation immunofluorescence × 400

圖 4 照射1、4、12周后，M3、AQP5和claudin-4的熒光強(qiáng)度變化Fig 4 The changes in the fluorescence intensity of M3,AQP5 and claudin-4 at 1,4 and 12 weeks after irradiation

嚙齒類動(dòng)物唾液腺經(jīng)15 Gy以上電離輻射后在早期表現(xiàn)為分泌功能快速降低，在中后期腺泡細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，在3月后進(jìn)入比較穩(wěn)定的緩慢恢復(fù)期。3 月內(nèi)對(duì)輻射損傷的下頜下腺、腮腺等局部或全身用藥干預(yù)均可顯著改善腺體分泌功能[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，電離輻射損傷后早期表現(xiàn)為組織水腫，而12 周進(jìn)入損傷后期表現(xiàn)為核固縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、病理性小灶壞死、腺泡細(xì)胞數(shù)量明顯降低[11]。通過(guò)下頜下腺插管，收集靜息狀態(tài)下單純下頜下腺唾液分泌量，計(jì)量顯示1、4 周唾液分泌量分別為（1.51±0.05）、（1.46±0.04）mm，較正常組顯著降低了28%、30%，12周時(shí)分泌降低達(dá)到43%，功能損傷進(jìn)一步加重，與組織學(xué)變化相一致。

圖 5 下頜下腺電離輻射后M3、AQP5、claudin-4的表達(dá)Fig 5 The expressions of M3,AQP5 and claudin-4 in submandibular glands after irradiation

唾液中水分約占99%，在正常腺體中主要由M3 受體參與調(diào)控完成。唾液腺水分泌有2 條主要的途徑，即經(jīng)水通道蛋白直接穿過(guò)基底膜和頂膜的跨細(xì)胞途徑和經(jīng)細(xì)胞間TJ調(diào)控的旁細(xì)胞途徑[12]。下頜下腺中M 受體是介導(dǎo)跨細(xì)胞及旁細(xì)胞途徑水分泌調(diào)控的重要信使，激活后可引起大鼠腮腺中AQP5 從細(xì)胞漿向頂膜的轉(zhuǎn)位，同時(shí)增加唾液的分泌。在放射性損傷的唾液腺以及舍格倫綜合征患者活檢的唇腺標(biāo)本中均可檢測(cè)到AQP5的表達(dá)量降低和在腺泡頂側(cè)膜的分布降低，提示AQP5的分布和含量是決定水的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素[3,13]。M3受體與AQP5 在對(duì)照腺體中含量更豐富，20 Gy 照射后隨著時(shí)間的推移在7 d 觀察到兩者蛋白表達(dá)明顯下降，第12 周時(shí)仍處于低水平。用免疫熒光顯微鏡觀察，則表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度減弱，AQP5 在頂膜和側(cè)膜分布明顯減少。因此，兩者蛋白的表達(dá)減少以及組織結(jié)構(gòu)損傷可能是照射后唾液流量減少的原因之一。此外，近年來(lái)的研究[14]提示促分泌藥物如卡巴膽堿、腎上腺素等可以促進(jìn)TJ 的通透性，增加水經(jīng)旁細(xì)胞途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而發(fā)揮促分泌的作用。如放射損傷前后給予M 受體激動(dòng)劑匹魯卡品可以一定程度抑制電離輻射損傷腺體的分泌低下，改善分泌功能[15]。這提示放療可能會(huì)直接損傷TJ 結(jié)構(gòu)，引起旁細(xì)胞分泌功能的降低。為此該實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡對(duì)放射后下頜下腺超微結(jié)構(gòu)進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組相鄰腺泡上皮細(xì)胞間靠近腺泡腔的位置可觀察到完整、清晰的細(xì)胞間TJ 結(jié)構(gòu)，它是介導(dǎo)水和電解質(zhì)經(jīng)旁細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的大分子蛋白復(fù)合物，主要行使“屏障”和“柵欄”功能[12,16]。電離輻射后1 周，TJ 結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為模糊、崩塌；4 周可見(jiàn)電子密度降低；12 周TJ結(jié)構(gòu)破壞最明顯，TJ 寬度較1、4 周均明顯降低（P<0.01）。TJ 寬度是一項(xiàng)可以反映其“屏障”功能的重要指標(biāo)，是指相鄰細(xì)胞的TJ之間的距離[17]。該結(jié)果說(shuō)明電離輻射造成TJ 結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致開放程度改變引起旁細(xì)胞途徑水轉(zhuǎn)運(yùn)能力改變。TJ 蛋白復(fù)合物主要由跨膜蛋白和胞漿蛋白構(gòu)成，跨膜蛋白通過(guò)胞外環(huán)相互作用封閉細(xì)胞旁間隙，clau‐dins作為跨膜蛋白的主要封閉蛋白，在維持上皮細(xì)胞“屏障”、保持TJ 完整性上發(fā)揮重要作用[18]。claudin-4 作為claudins 家族成員之一，主要分布、表達(dá)于大鼠下頜下腺細(xì)胞膜上，經(jīng)激活M3受體調(diào)控claudin-4 的表達(dá)可增加旁細(xì)胞途徑的通透性[2]。在嚙齒動(dòng)物唾液腺中claudin-4 僅在導(dǎo)管細(xì)胞中表達(dá)[19]，其表達(dá)量的變化會(huì)影響TJ 的屏障特性，當(dāng)其表達(dá)增加會(huì)引起下頜下腺腺泡細(xì)胞的跨上皮電阻升高，降低細(xì)胞的通透性[20]。在本研究中，輻照后TJ 蛋白分子claudin-4 表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增加，引起了不可逆的分泌功能障礙。通常正常大鼠claudin-4 的表達(dá)水平很低，claudin-4 特異性定位于導(dǎo)管，腺泡幾乎無(wú)表達(dá)，而導(dǎo)管組織占腺體體積的10%以下，其整個(gè)腺體表達(dá)水平在免疫印跡分析中顯得微弱。該研究中claudin-4 在照射后1 周和4 周被清楚地檢測(cè)到明顯增加，12周時(shí)仍處于高表達(dá)水平。在電離輻射后claudin-4 無(wú)論是蛋白表達(dá)量還是在腺泡以及導(dǎo)管上皮分布的熒光強(qiáng)度，均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，提示claudin-4 發(fā)生了重分布，會(huì)引起下頜下腺腺泡細(xì)胞的跨上皮電阻增加，降低細(xì)胞的通透性。電離輻射后TJ 結(jié)構(gòu)損傷，可能是輻射損傷唾液分泌降低的重要機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，大鼠下頜下腺經(jīng)電離輻射后腺泡細(xì)胞數(shù)目減少，AQP5跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路受損，TJ寬度發(fā)生變化，而claudin-4表達(dá)增高，這提示M3受體介導(dǎo)的旁細(xì)胞水分泌途徑改變也參與了電離輻射對(duì)下頜下腺分泌減少。這些發(fā)現(xiàn)豐富了對(duì)唾液腺放射損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并可能為放療損傷后下頜下腺分泌功能減退的治療策略提供新的見(jiàn)解。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。