王 偉， 燕迪迪，丁 爽，倪凱園，姜國忠

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

食管癌在全球癌癥發(fā)病率中排名第7，病死率排名第6[1]。我國90%以上的食管癌病例是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]。由于ESCC起病隱匿，多數患者診斷時已是晚期，預后很差。因此，明確ESCC發(fā)生及發(fā)展的分子機制，探尋有效的生物標志物及治療靶標對于ESCC的早期診斷、精準治療和復發(fā)預測意義重大。環(huán)狀RNA是一類閉合成環(huán)的非編碼RNA，不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴[3]。目前的研究[4-6]表明環(huán)狀RNA參與了基因的翻譯調控并介導了多種腫瘤的進展。如環(huán)狀RNA_0000263在宮頸癌細胞系中的表達顯著增加，環(huán)狀RNA_0000263/miR-150-5p/MDM4調控軸可能通過影響p53基因的表達在宮頸癌的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。環(huán)狀RNA_LDLRAD3在胰腺癌組織和細胞系中高表達,下調其表達可以通過調控miR-137-3p/PTN軸抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[5]。環(huán)狀RNA_CDK13在肝癌細胞和組織中表達降低,上調環(huán)狀RNA_CDK13表達可顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并改變細胞周期進程[6]。本研究檢測了環(huán)狀RNA_8199在ESCC細胞中的表達情況，探討上調環(huán)狀RNA_8199表達對ESCC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊公司，基因組DNA(gDNA)提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司，ABI7500熒光PCR儀購自美國ABI公司。RNase R購自北京天根生化科技有限公司。免疫熒光探針由上海吉瑪公司合成，雜交試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司，核漿分離試劑盒購自廣州博徠斯生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，離心機購自德國Eppendorf公司，CCK-8購自日本同仁試劑公司，Transwell小室購自美國Coming公司。

1.2細胞來源及培養(yǎng)人ESCC細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270、KYSE520、KYSE150、KYSE410購自ATCC細胞庫。細胞用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為體積分數5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.3RT-PCR檢測KYSE520細胞中環(huán)狀RNA_8199的表達Trizol法提取KYSE520細胞總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA，用gDNA提取試劑盒提取KYSE520細胞gDNA，并將反轉錄產物cDNA和gDNA進行PCR擴增。使用發(fā)散引物(上游引物5’-ATGTGGCCAATGGGTTTAAG-3’，下游引物5’-GCAAGCTCAACAGCATGAGA-3’)擴增環(huán)狀轉錄本，使用聚合引物(上游引物5’-GAAACAGCAC CCAGGACTA-3’,下游引物5’-CTGATTGAATTCTG GTTCACAG-3’)擴增線性轉錄本，GAPDH(上游引物5’-GAGTCCACTGGCGTCTTCA-3’，下游引物5’-TGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3’)作為內參，引物均由北京擎科生物技術有限公司鄭州分公司合成。將PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，后置于凝膠成像儀上觀察，拍照記錄。

1.4Sanger測序鑒定環(huán)狀RNA_8199的環(huán)化剪接點序列從環(huán)狀RNA Base數據庫獲取環(huán)狀RNA_8199序列，據此設計一對引物以擴增包含反向剪切位點的序列，上游引物5’-GCTTCAGGTGTCTTCG CAAT-3’，下游引物5’-AATCTTCATTCCGTGAG GCAAT-3’。以KYSE150和KYSE410細胞的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后，送河南尚亞生物技術有限公司完成測序驗證。

1.5環(huán)狀RNA_8199在KYSE520細胞中的特性表達Trizol法提取KYSE520細胞中總RNA，將提取的RNA分為RNase R處理組和對照組各10 μg。RNase R處理組用20 U RNase R處理(2 U/μg)，對照組用等量雙蒸水替代,于37 ℃孵育10 min。兩組分別取等量消化產物反轉錄為cDNA，通過qRT-PCR法檢測環(huán)狀RNA_8199和ATXN10 mRNA的表達，選用 GAPDH 作為內參。反應體系共20 μL:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL,上、下游引物各0.8 μL,滅菌蒸餾水6 μL,cDNA 2 μL。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.6細胞免疫熒光法和核漿分離法檢測環(huán)狀RNA_8199在KYSE520和KYSE270細胞中的亞定位①將KYSE520和KYSE270細胞以每孔6×104個細胞分別接種于12孔板里，棄去培養(yǎng)基，PBS浸洗3次；每孔中加入1 mL 40 g/L多聚甲醛，室溫下固定15 min，PBS洗滌3次；加入體積分數1%的Triton破膜15 min，用PBS洗滌3 次后加入體積分數10%的山羊血清室溫下封閉1 h；除去山羊血清，加入探針對環(huán)狀RNA_8199序列的反向剪接區(qū)進行熒光原位雜交，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；熒光顯微鏡下觀察及照相。②根據核漿分離試劑盒說明對KYSE520和KYSE270細胞進行核漿分離，細胞漿定位內參為S14，細胞核定位內參為U2。qRT-PCR法分別檢測細胞核、漿中環(huán)狀RNA_8199的表達，選用GAPDH作為內參。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.7細胞轉染及分組通過Lipofectamine 2000將高表達環(huán)狀RNA_8199的質粒載體(環(huán)狀RNA_8199-OE)及陰性對照(環(huán)狀RNA_8199-NC)分別轉染到KYSE30和KYSE70細胞中，48 h后收集細胞并用于后續(xù)實驗。

1.8CCK-8實驗檢測環(huán)狀RNA_8199對KYSE30、KYSE70細胞增殖能力的影響將轉染后的KYSE30、KYSE70細胞以每孔2×103個細胞分別接種于96孔板，培養(yǎng)24、48、72和96 h。每個時間點分別向孔中加入 10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的OD值。實驗重復3次。

1.9平板克隆形成實驗檢測環(huán)狀RNA_8199對KYSE30、KYSE70細胞克隆形成能力的影響將轉染后的KYSE30、 KYSE70細胞接種于6孔板中(每孔300個細胞)，在37 ℃、體積分數5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)14 d，室溫下甲醛固定15 min，結晶紫染色15 min，沖洗并干燥后置于低倍鏡下觀察，含有50個細胞以上的集落視為一個克隆，計數克隆數。實驗重復3次。

1.10Transwell實驗檢測環(huán)狀RNA_8199對KYSE30細胞遷移和侵襲能力的影響細胞遷移實驗：將轉染后的KYSE30細胞加入無血清培養(yǎng)基中重懸，得到的細胞懸液調整至密度為2×105個/mL，上室中加入200 μL細胞懸液，同時將600 μL含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640加入下室，培養(yǎng)24 h后取出，甲醛固定后用結晶紫溶液染色30 min，PBS沖洗，于100倍鏡下選取5個視野觀察，計數穿過小室細胞數目。細胞侵襲實驗：用 Matrigel基質膠涂于上室，余實驗步驟同上。實驗重復3次。

1.11統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0進行數據分析。兩組間OD值的比較采用2×4析因設計的方差分析;細胞漿和細胞核中環(huán)狀RNA_8199相對表達量,兩組間環(huán)狀RNA_8199和ATXN10 mRNA相對表達量、細胞克隆形成數、遷移細胞數、侵襲細胞數的比較采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1KYSE520細胞中環(huán)狀RNA_8199的表達結果見圖1。環(huán)狀轉錄本只能通過發(fā)散引物在cDNA中擴增出來，而線性轉錄本可通過聚合引物同時在cDNA 和gDNA中擴增出來。

M：Marker；內向箭頭指聚合引物，外向箭頭指發(fā)散引物

2.2環(huán)狀RNA_8199環(huán)化剪接點序列的Sanger測序Sanger測序結果證實了環(huán)狀RNA_8199的環(huán)化剪接點序列，見圖2。

圖2 環(huán)狀RNA_8199環(huán)化剪接點序列的Sanger測序結果

2.3對照組與RNaseR處理組環(huán)狀RNA_8199、ATXN10mRNA相對表達量的比較結果見表1。RNase R處理后環(huán)狀RNA_8199對應的線性轉錄物ATXN10 mRNA表達水平下降，環(huán)狀RNA_8199的環(huán)狀轉錄物的表達水平無改變。

表1 兩組環(huán)狀RNA_8199、ATXN10 mRNA相對表達量的比較(n=3)

2.4KYSE520和KYSE270細胞中環(huán)狀RNA_8199的亞定位環(huán)狀RNA_8199主要定位于細胞漿中，見圖3。核漿分離實驗顯示，KYSE520和KYSE270細胞中環(huán)狀RNA_8199在細胞漿水平高于細胞核水平，見表2。

圖3 細胞免疫熒光法檢測KYSE520和KYSE270細胞中環(huán)狀RNA_8199亞定位結果(×200)

表2 KYSE520和KYSE270細胞漿和細胞核中環(huán)狀RNA_8199表達水平的比較(n=3)

2.5上調環(huán)狀RNA_8199表達對ESCC細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響結果見表3、4。與環(huán)狀RNA_8199-NC組相比，環(huán)狀RNA_8199-OE組ESCC細胞OD值、克隆形成數、遷移細胞數和侵襲細胞數均下降。

表3 兩組KYSE30、KYSE70細胞OD值比較(n=3)

表4 兩組ESCC細胞克隆形成數、遷移細胞數與侵襲細胞數比較(n=3)

3 討論

食管癌是世界范圍內發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一[1]，據統(tǒng)計2017年全球新增食管癌病例約為47萬[2]。由于食管癌起病隱匿且侵襲性強，多數患者就診時已是晚期，5 a生存率不足20%[7]。因此，我們迫切需要進一步研究ESCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，探尋有效的生物標志物及治療靶標。

環(huán)狀RNA是一類表達穩(wěn)定且進化保守的非編碼RNA，自身或其調控通路的紊亂可導致多種疾病的發(fā)生。大多數環(huán)狀RNA存在于細胞質中，通過與細胞質中的miRNA和蛋白相互作用共同發(fā)揮調控功能[8]。證據表明環(huán)狀RNA在多種腫瘤中表達異常。如環(huán)狀RNA_FGFR1在非小細胞肺癌組織中表達上調，通過海綿吸附作用與miR-381-3p共同導致非小細胞肺癌進展和免疫逃避的發(fā)生[9]。環(huán)狀RNA_LONP2在結腸癌組織中表達上調，且可通過調節(jié)miR-17的成熟來增強結腸癌細胞的侵襲和轉移能力[10]。環(huán)狀RNA_MBOAT2在前列腺癌組織和細胞系中表達上調，過表達環(huán)狀RNA_MBOAT2可以促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。

文獻[12-14]證實環(huán)狀RNA可以調控ESCC的進展并影響其預后，具有成為ESCC預測因子和治療靶點的潛力。環(huán)狀RNA_0004771在ESCC患者血漿和組織中表達上調，并通過調控miR-339-5p/CDC25A促進ESCC進展[12]。環(huán)狀RNA_LARP4在ESCC細胞系中表達下調，過表達環(huán)狀RNA_LARP4可以抑制ESCC細胞增殖和遷移并促進凋亡[13]。環(huán)狀RNA_0012563在ESCC中表達顯著上調,敲低環(huán)狀RNA_0012563可以抑制XRCC1介導的EMT通路，從而抑制ESCC細胞的遷移和侵襲能力[14]。

本研究首先采用RT-PCR法檢測了KYSE520細胞中環(huán)狀RNA_8199的表達情況，并進一步采用Sanger測序法鑒定了其環(huán)化剪接位點。環(huán)狀RNA的閉合成環(huán)結構使其與線性RNA相比，表達水平更加穩(wěn)定[15]。通過RNase R實驗發(fā)現，RNase R處理后環(huán)狀RNA_8199的表達水平與對照組相比無明顯改變，而ATXN10 mRNA的表達水平與對照組相比明顯下降，證明了環(huán)狀RNA_8199相比于線性轉錄本更能抵抗RNase R消化作用。細胞免疫熒光和核漿分離實驗證明了環(huán)狀RNA_8199主要存在于細胞漿中。另外，本研究還探索了環(huán)狀RNA_8199對ESCC細胞生物學行為的影響。我們構建了高表達環(huán)狀RNA_8199質粒載體并轉染ESCC細胞，通過CCK-8實驗、平板克隆形成實驗及Transwell 實驗發(fā)現，上調ESCC細胞中環(huán)狀RNA_8199表達后，細胞的增殖活性明顯降低，細胞克隆形成數目明顯減少，侵襲與遷移能力明顯受到抑制。這表明環(huán)狀RNA_8199參與并影響了ESCC的發(fā)生發(fā)展，因此，有望成為ESCC基因治療的新靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現環(huán)狀RNA_8199與ESCC的發(fā)生發(fā)展有關，提示環(huán)狀RNA_8199可能是食管癌診療的有效靶點之一。然而我們的研究仍有一定的局限性，如環(huán)狀RNA_8199抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力的具體作用機制尚不清楚，因此，還需進一步探索環(huán)狀RNA_8199發(fā)揮各種生物學功能的具體機制。