趙媛媛，張 楠，孫維義，郅 強

1)河南中醫(yī)藥大學 鄭州 450000 2)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)腔鏡外科 鄭州 450046

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，危及人們健康和生命安全，在我國發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。結(jié)直腸癌的治療包括手術(shù)、化療、中醫(yī)藥治療等。黃芪多糖是豆科植物黃芪的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性，尤其是多重抗腫瘤活性作用備受關(guān)注[2]。有研究[3-4]報道，黃芪多糖可以通過誘導腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)、抑制新生血管形成、抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等多種機制發(fā)揮廣譜抗腫瘤作用。結(jié)直腸癌的生長與多種炎性因子關(guān)系密切，其中白介素17(interleukin-17，IL-17)參與炎癥反應和免疫反應，在結(jié)直腸癌患者血清中高表達，促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[5]。IL-17主要由Th17細胞產(chǎn)生，在轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)和IL-6共同誘導下，通過TGF-β1信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3及干擾素調(diào)節(jié)因子4，調(diào)節(jié)誘導CD4+T細胞向Th17細胞分化[6-7]。結(jié)直腸癌組織中TGF-β1含量升高與結(jié)直腸癌惡性程度、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[8]。目前有研究表明黃芪多糖能夠體外抑制結(jié)直腸癌HCT-116細胞侵襲和遷移[3]，體外抑制結(jié)直腸癌HT-29細胞增殖[9]。然而，黃芪多糖在體內(nèi)抗結(jié)直腸癌活性及其具體抗腫瘤機制尚不清楚。本研究擬探討黃芪多糖對BALB/C裸鼠結(jié)直腸癌移植瘤生長的影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、動物和主要材料HCT-116細胞由山東大學病理實驗室提供；SPF級雄性BALB/C nu/nu裸鼠購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，實驗動物合格證號SCXK(豫)2019-0002。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶細胞消化液、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液均購自Biosharp公司，PBS購自HyClone。注射用黃芪多糖購自天津賽諾制藥有限公司，氟尿嘧啶注射液購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，生理鹽水注射液購自河南科倫藥業(yè)有限公司。小鼠血清IL-17和TGF-β1 ELISA試劑盒購自CUSABIO公司，HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2HCT-116細胞培養(yǎng)及結(jié)直腸癌移植瘤模型的建立HCT-116細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至約90%融合時進行傳代或凍存，取3代后的細胞用于后續(xù)實驗。

收集處于對數(shù)生長期的HCT-116細胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107個/mL。用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞懸液注射至BALB/C裸鼠腋下稍偏背側(cè)。接種腫瘤細胞后，觀察裸鼠飲食、精神和活動狀態(tài)。

1.3實驗動物分組及處理接種第10天，將接種部位皮下結(jié)節(jié)體積大于62.5 mm3的裸鼠按照隨機數(shù)字表法分為3組：模型對照組、黃芪多糖組和氟尿嘧啶組，每組10只。模型對照組腹腔注射生理鹽水(20 mL/kg)，1次/d，連續(xù)21 d；黃芪多糖組給予黃芪多糖(250 mg/kg)，腹腔注射，1次/d，連續(xù)21 d；氟尿嘧啶組給予氟尿嘧啶(200 mg/kg)，腹腔注射，1次/周，連續(xù)3周。

1.4觀察指標

1.4.1 裸鼠體重及瘤體體積測量 實驗期間用電子天平稱量裸鼠體重，游標卡尺測量移植瘤長徑(a)、短徑(b)，按照體積公式V=1/2(ab2)計算移植瘤體積，造模后每3 d測量1次。

1.4.2 血清IL-17、TGF-β1水平的ELISA法檢測 給藥21 d后，裸鼠用體積分數(shù)4%水合氯醛麻醉，心臟取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取血清備用。參照ELISA檢測試劑盒說明書操作步驟，檢測血清TGF-β1、IL-17水平。

1.4.3 裸鼠瘤體、肝臟的病理學表現(xiàn) 分離裸鼠皮下移植瘤瘤體及肝尾狀葉，40 g/L多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片(4 μm厚)、HE染色后，于光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，應用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組裸鼠移植瘤瘤體生長情況；應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較3組裸鼠血清IL-17與TGF-β1水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組裸鼠一般情況及體重變化情況接種后4～7 d開始長出瘤體，30只BALB/C裸鼠均荷瘤成功，早期飲食、體重、精神狀態(tài)、活動度等情況沒有明顯改變。隨著荷瘤生存時間延長以及藥物干預，荷瘤裸鼠體重降低，個別裸鼠出現(xiàn)腹瀉；荷瘤期間黃芪多糖組、氟尿嘧啶組各死亡1只。氟尿嘧啶組裸鼠在給藥后出現(xiàn)食欲減退、精神活動差、皮膚粗糙、消瘦和體重減輕現(xiàn)象；與氟尿嘧啶組相比，黃芪多糖組裸鼠體重減輕不明顯。

2.2各組裸鼠移植瘤瘤體生長變化情況在給藥1周后黃芪多糖組瘤體體積明顯低于模型對照組(P<0.05)；黃芪多糖組與氟尿嘧啶組比較，瘤體體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組裸鼠移植瘤瘤體體積比較 mm3

2.3各組腫瘤組織及肝臟組織病理學變化藥物干預21 d經(jīng)麻醉后剝離腫瘤標本，瘤體邊界清晰、不規(guī)則、質(zhì)硬，與周圍組織粘連致密，剝離后可見完整被膜包被，呈淡粉色。模型對照組腫瘤組織增生、血管增生和細胞異型性明顯，腫瘤細胞形狀排列不規(guī)則，細胞體積偏大(圖2A1)；肝尾狀葉可見多個散在結(jié)節(jié)，組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有核大、深染的團狀癌組織分布(圖2A2、3)。與模型對照組比較，黃芪多糖組腫瘤組織異型性不明顯，血管增生少，腫瘤細胞體積小(圖2B1)，肝尾狀葉未見明顯結(jié)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移灶浸潤和肝細胞損害(圖2B2、3)；氟尿嘧啶組腫瘤組織異型性、血管增生不明顯(圖2C1)，肝尾狀葉細胞腫脹、體積增大，局部可見炎性細胞浸潤現(xiàn)象(圖2C2、 3)。

A：模型對照組；B：黃芪多糖組；C：氟尿嘧啶組；1：移植瘤鏡下觀(×100)；2：肝尾狀葉大體觀；3：肝尾狀葉鏡下觀(×100)

2.4各組裸鼠血清IL-17與TGF-β1水平變化見表2。與模型對照組比較，黃芪多糖組血清IL-17與TGF-β1水平降低(P<0.05)；與氟尿嘧啶組比較，黃芪多糖組血清IL-17水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組裸鼠血清IL-17與TGF-β1水平比較

3 討論

黃芪多糖是豆科植物黃芪的主要活性成分，可以有效增強細胞活性，維持細胞的正常結(jié)構(gòu)，降低肺癌患者外周循環(huán)髓源性抑制細胞水平，改善機體免疫功能[10]，還可以有效促進抗原遞呈的能力，發(fā)揮CD8+T細胞的功能，增強機體抑制腫瘤發(fā)生與進展的能力[11-12]，表現(xiàn)出多重抗腫瘤作用。

本實驗結(jié)果顯示，黃芪多糖治療后裸鼠體重降低不明顯，瘤體體積生長明顯低于模型對照組，腫瘤細胞增殖、侵襲和異型性不明顯，肝臟無明顯轉(zhuǎn)移灶，這與王旗等[3]干預體外培養(yǎng)人結(jié)直腸癌HCT-116細胞抑制腫瘤細胞侵襲和遷移結(jié)果一致。與氟尿嘧啶組比較，裸鼠體重減輕幅度小，且肝臟細胞無明顯損害。這些結(jié)果表明黃芪多糖可通過改善機體免疫應答、提高機體免疫功能發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤作用。

腫瘤在體內(nèi)生長不僅依賴于腫瘤細胞自身的生長，還與血管等其他因素密切相關(guān)。體內(nèi)實驗影響因素廣泛，更能有效擬合真實世界，尤其是腫瘤對機體的整體影響，更能直觀觀察侵襲性轉(zhuǎn)移。IL-17可能通過局部炎癥導致腫瘤細胞生存、增殖，形成一個有利于腫瘤細胞生長的免疫微環(huán)境，并通過促進腫瘤血管的生成促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[13]。TGF-β1是血管生長的重要標志因子，通過激活腫瘤相關(guān)成纖維細胞促進腫瘤新生血管生成，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組相比，黃芪多糖治療后裸鼠血清IL-17和TGF-β1蛋白表達水平降低，這表明黃芪多糖可能通過抑制裸鼠體內(nèi)IL-17和TGF-β1蛋白表達從而達到抗結(jié)直腸腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，黃芪多糖是高效低毒的抗腫瘤藥物，并且抗腫瘤作用與TGF-β1和IL-17蛋白密切相關(guān)。這為下一步探索黃芪多糖對腫瘤生長轉(zhuǎn)移作用機制的研究提供了實驗基礎(chǔ)。