劉晶晶，王 燕，王辛宇，李曉天

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 2)江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所分子影像中心 江蘇無(wú)錫 214063

細(xì)胞治療是指將正?；蚪?jīng)過生物工程改造后的人體細(xì)胞輸入或移植到患者體內(nèi)，以替代體內(nèi)已受損細(xì)胞或者獲得更強(qiáng)的免疫殺傷能力，從而達(dá)到治療疾病的目的。按照細(xì)胞種類可分為干細(xì)胞治療和免疫細(xì)胞治療兩大類。其中干細(xì)胞治療廣泛用于癌癥、脊髓損傷、腦損傷以及神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病的治療[1-4]；免疫細(xì)胞治療既可以單獨(dú)使用，也可以和其他療法(如化療等)結(jié)合用于癌癥的治療。癌癥免疫治療被《科學(xué)》雜志評(píng)為2013年度十大最佳科學(xué)突破之首[5]。截至2019年4月，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)免疫治療用于治療近20種癌癥如腦癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤等[6]。

截至2019年，全球已有幾十種細(xì)胞治療產(chǎn)品獲批上市。為了確保細(xì)胞治療的安全性和有效性，加快其臨床轉(zhuǎn)化，需要對(duì)移植細(xì)胞的定位、存活等動(dòng)態(tài)生物學(xué)行為進(jìn)行非侵襲性縱向評(píng)估[7]。目前臨床上傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)體內(nèi)輸注細(xì)胞生物學(xué)行為的方法主要包括：血清中與T細(xì)胞活化相關(guān)的細(xì)胞因子分析、外周血中腫瘤特異性T細(xì)胞計(jì)數(shù)和腫瘤組織活檢[8]，但存在以下缺點(diǎn)：臨床上只能獲得血藥濃度數(shù)據(jù)；不能在活體內(nèi)獲得多個(gè)時(shí)間點(diǎn)血藥濃度與組織分布數(shù)據(jù)；無(wú)法同時(shí)監(jiān)測(cè)人體各組織藥物暴露量；靶組織特異性差、創(chuàng)傷大等。傳統(tǒng)分析技術(shù)不能為臨床治療提供可靠的參考，難以滿足臨床需要。因此，加強(qiáng)對(duì)體內(nèi)輸注細(xì)胞有效示蹤的研究，是解決細(xì)胞類藥物研發(fā)“瓶頸”的關(guān)鍵。迄今為止，尚無(wú)可用于活體細(xì)胞類藥物體內(nèi)示蹤的標(biāo)準(zhǔn)化方法。

2017年12月22日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)發(fā)布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》中指出，“細(xì)胞治療產(chǎn)品的分布及存續(xù)時(shí)間是影響細(xì)胞治療產(chǎn)品有效性和安全性的最重要因素，應(yīng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，必要時(shí)觀察至這些細(xì)胞的消失或功能喪失。可選擇的技術(shù)方法有影像技術(shù)、PCR技術(shù)、免疫組化技術(shù)等?！庇跋窦夹g(shù)已經(jīng)被批準(zhǔn)用于細(xì)胞類治療產(chǎn)品的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。目前活體影像技術(shù)有很多，已提出可用于活體內(nèi)細(xì)胞行為示蹤的成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging,BLI)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、正電子發(fā)射斷層成像(positron emission tomography,PET)和單光子斷層顯像(single photon emission computed tomography,SPECT)等，這些技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞類藥物在乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種模型的臨床前及臨床研究[9-12]。本文擬對(duì)常用影像監(jiān)測(cè)手段的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析討論，并展望此類監(jiān)測(cè)方法的發(fā)展方向。

1 BLI

BLI即利用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，活體內(nèi)注射熒光素后顯像，直接監(jiān)控體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)或基因行為。BLI由熒光素酶催化、氧化其底物熒光素而發(fā)光，由于不需要外部光，具有較低的背景，使得生物發(fā)光標(biāo)記物在體內(nèi)易于識(shí)別監(jiān)測(cè)[13-14]。

長(zhǎng)期以來(lái)，生物發(fā)光一直被用于追蹤組織和生物體中的細(xì)胞、基因表達(dá)以及其他生物學(xué)特征[15]。常用的熒光素酶主要有螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)luc)、海腎熒光素酶(renilla luciferase，Rluc)和高斯熒光素酶(gaussia luciferase，Gluc)等[16]。其中Fluc廣泛應(yīng)用于臨床前小動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞類藥物監(jiān)測(cè)成像。2003年，Wang等[17]首次利用表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的慢病毒感染從造血干細(xì)胞中分離的CD34+細(xì)胞，使其穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶，進(jìn)而通過尾靜脈注射入NOD/SCID/β2mnull小鼠體內(nèi)，采用BLI追蹤細(xì)胞在骨髓內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞在脊柱、骨盆和股骨的信號(hào)最強(qiáng)，在顱骨和肱骨信號(hào)較低。BLI為追蹤人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的體內(nèi)移植動(dòng)態(tài)行為提供了一種新的方法，揭示了人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞在活宿主骨髓空間中移植和增殖的動(dòng)態(tài)信息。Steiner等[18]用表達(dá)Fluc的慢病毒構(gòu)建感染CD34+臍帶血來(lái)源的造血干細(xì)胞，體外擴(kuò)增后通過尾靜脈輸注入NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG)小鼠(預(yù)先用亞致死劑量照射)體內(nèi)，通過BLI評(píng)估發(fā)現(xiàn)，體外擴(kuò)增的臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞可以產(chǎn)生持久的多系移植，幾乎與未擴(kuò)增的臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞相當(dāng)。然而，BLI的靈敏度和空間分辨率均較低，無(wú)法檢測(cè)少量細(xì)胞；另外，活體組織對(duì)光的高吸收率和高散射性限制了光學(xué)信號(hào)的組織穿透力，以致只能檢測(cè)距離皮膚2～3 cm的深度。因此，這種淺表成像只能在實(shí)驗(yàn)室的小動(dòng)物研究中應(yīng)用，臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值較小。

總之，BLI顯像易于實(shí)施、成本低、無(wú)電離輻射，但由于空間分辨率較低，組織穿透力有限，目前僅限于在小動(dòng)物體內(nèi)示蹤轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞等[19-20]。BLI的臨床應(yīng)用尚需要開發(fā)一些新的可用于人類的特異性分子探針[21]。

2 MRI

MRI是利用磁場(chǎng)可監(jiān)測(cè)原子核核磁共振的現(xiàn)象，使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)人體各器官及不同生理狀態(tài)的組織進(jìn)行成像的輔助診斷技術(shù)，具有無(wú)創(chuàng)、分辨率高、無(wú)輻射損傷等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于活體細(xì)胞的體內(nèi)示蹤[22]。自1992年首次報(bào)道運(yùn)用超順磁性造影劑對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中移植的前體細(xì)胞進(jìn)行示蹤以來(lái)，MRI已被用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞類藥物在多種動(dòng)物模型中的分布和遷移，特別是在心臟、肝臟和腦部等疾病模型中[23-24]。

細(xì)胞MRI標(biāo)記物有兩大類：T1類陽(yáng)性造影劑和T2類陰性造影劑。T1類主要有釓(Gd)、錳(Mn)，如Gd-DTPA(二乙三胺五醋酸釓)、Gd-DTPA-BMA(釓二胺)等，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、毒性低、順磁性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于腦部疾病的研究[25]。Gd3+是一種重金屬造影劑，造影增強(qiáng)的病變或標(biāo)記的移植干細(xì)胞在T1加權(quán)像上表現(xiàn)為高強(qiáng)度，而在T2加權(quán)像上表現(xiàn)為低強(qiáng)度，因?yàn)榛贕d3+的造影可以縮短T1和T2的弛豫時(shí)間[26]。另一種造影劑為Mn2+,一方面，由于Mn2+具有與Ca2+相似的離子性質(zhì)，可被腦和脊髓的興奮性細(xì)胞通過電壓門控Ca2+通道和Na+/Ca2+交換器而吸收，另一方面，Mn2+可以通過與特定蛋白質(zhì)和核酸上的Ca2+和Mg2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，從而標(biāo)記移植細(xì)胞的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)行為。與陽(yáng)性造影劑相比，陰性造影劑更為常用，主要有超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)、超小型超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)和微米大小的氧化鐵粒子(micron-sized particles of iron oxide,MPIOS)等[27]。Daldrup-Link等[28]用納米氧化鐵顆粒標(biāo)記巨噬細(xì)胞，通過MRI監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植后的排斥反應(yīng)。自2005年首次使用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)治療腦卒中以來(lái)，相關(guān)臨床試驗(yàn)也已廣泛開展。Shichinohe等[29]用SPIO標(biāo)記BMSC進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)，通過腦梗死區(qū)域立體定向給藥，使用MRI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤以評(píng)估BMSC用于急性缺血性卒中患者的安全性，結(jié)果證實(shí)SPIO-BMSC特異性地向病灶遷移，有助于臨床試驗(yàn)選擇合適的給藥位置并闡明了治療機(jī)制。然而，用磁性造影劑標(biāo)記細(xì)胞存在一些局限性，細(xì)胞標(biāo)記會(huì)隨移植入體內(nèi)細(xì)胞的增殖而被稀釋，導(dǎo)致監(jiān)測(cè)信號(hào)減少甚至丟失；此外，移植入體內(nèi)的被標(biāo)記細(xì)胞會(huì)被免疫細(xì)胞(如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞)吞噬，造成磁性顆粒沉積，導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)，甚至影響使用者的長(zhǎng)期健康[30]。

簡(jiǎn)言之，MRI用于活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤的優(yōu)點(diǎn)包括高分辨率、無(wú)電離輻射和三維解剖成像能力；缺點(diǎn)包括本底較高，定量難度大，以及無(wú)法監(jiān)測(cè)細(xì)胞的存活、增殖、分化等情況。

3 核醫(yī)學(xué)成像

核醫(yī)學(xué)成像又稱放射性核素成像(radio nuclear imaging,RNI)，圖像信號(hào)反映放射性核素的分布，主要包括PET和SPECT兩種成像方式。與MRI相比，核醫(yī)學(xué)成像具有更高的靈敏度。

SPECT顯像以發(fā)射單光子的放射性核素為探測(cè)對(duì)象，臨床上主要用于腫瘤學(xué)和神經(jīng)病學(xué)等疾病的診斷、治療。用于活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤的探針主要由兩種放射性核素標(biāo)記：111In和99mTc[31]。111In半衰期為2.8 d，在金屬離子載體8-羥基喹啉存在的情況下與待測(cè)細(xì)胞體外孵育即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記，通過SPECT對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行5 ～ 7 d的連續(xù)監(jiān)測(cè)，已被FDA批準(zhǔn)用于臨床各類細(xì)胞示蹤[32]。但這種標(biāo)記是可逆的，標(biāo)記細(xì)胞的穩(wěn)定性不佳，放射性核素易從標(biāo)記部位解離，造成假陽(yáng)性信號(hào)。另一種核素標(biāo)記99mTc，半衰期較短(6 h)，不能用于長(zhǎng)期示蹤。此外，從細(xì)胞解離、流出胞外的99mTc也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。

與SPECT相比，PET顯像具有更高的靈敏度和分辨率。PET顯像以正電子核素在湮沒時(shí)發(fā)射出的雙光子為探測(cè)對(duì)象。利用正電子核素標(biāo)記的葡萄糖、小分子藥物、肽段或納米材料等作為分子探針，從分子水平上反映組織的生理、病理、生化、代謝等功能性變化和體內(nèi)受體的分布情況，是臨床前和臨床研究中活細(xì)胞體內(nèi)示蹤的一種獨(dú)特而重要的工具[11,33]。

臨床上常用的PET顯像的放射性核素主要有：89Zr(半衰期78.4 h)、18F(半衰期109.8 min)、68Ga(半衰期68.1 min)[34-35]等。常用的標(biāo)記方法是對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行直接標(biāo)記，短半衰期的核素限制了可監(jiān)測(cè)時(shí)間，適用于細(xì)胞初始分布的短期監(jiān)測(cè)，不適合對(duì)細(xì)胞的分布、歸巢、增殖等長(zhǎng)期行為進(jìn)行評(píng)估。89Zr半衰期為78.4 h，具有相對(duì)低的正電子能量(395.5 keV)，適合標(biāo)記生物半衰期較長(zhǎng)的藥物載體(如納米類藥物、抗體等)，可對(duì)標(biāo)記藥物進(jìn)行2～3周的監(jiān)測(cè)。近年來(lái)，利用89Zr核素標(biāo)記細(xì)胞的臨床前研究已有諸多報(bào)道[36-38]。Lee等[39]用89Zr-p-異硫氰酸苯甲酰去鐵氧胺(Df-Bz-NCS，DFO)對(duì)嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)進(jìn)行直接標(biāo)記，通過PET監(jiān)測(cè)細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。在注射標(biāo)記細(xì)胞后，成功檢測(cè)到標(biāo)記的CAR-T在肺部、肝臟以及脾臟的轉(zhuǎn)移，表明利用89Zr-DFO直接標(biāo)記的PET成像技術(shù)可用于活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤。直接標(biāo)記簡(jiǎn)單且較易操作，適用于細(xì)胞初始分布的短期研究，其長(zhǎng)期示蹤潛力會(huì)受到以下因素的影響：放射性核素的衰變、細(xì)胞分裂導(dǎo)致的標(biāo)記稀釋、放射性核素離開細(xì)胞時(shí)的非特異性攝取以及細(xì)胞死亡后標(biāo)記的持久存在等。

報(bào)告基因?yàn)榛铙w細(xì)胞體內(nèi)示蹤提供了另一種方法，可以對(duì)細(xì)胞的分布、遷移(歸巢)、增殖、存活進(jìn)行更精確的監(jiān)測(cè)。已報(bào)道的PET顯像報(bào)告基因主要有：?jiǎn)渭儼捳畈《?型胸苷激酶、前列腺特異性膜抗原(prostrate specific membrane antigen,PSMA)、多巴胺D2受體、生長(zhǎng)抑素受體亞型2、人鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體等，現(xiàn)已有很多相關(guān)研究[8,40]。Minn等[41]對(duì)CD19 CAR-T用PSMA(一種正常組織表達(dá)受限的人類蛋白)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后將其注入NSG小鼠急性淋巴細(xì)胞白血病模型進(jìn)行治療，用[18F]DCFPyL對(duì)CD19 CAR-T進(jìn)行標(biāo)記，通過PET與BLI監(jiān)測(cè)CAR-T的體內(nèi)行為。PET顯像結(jié)果顯示注射CAR-T治療后的第5天，骨髓轉(zhuǎn)移病灶處有放射性濃聚，表明有CAR-T浸潤(rùn)；治療后的第11天， 細(xì)胞明顯浸潤(rùn)在腫瘤原發(fā)病灶。BLI顯像表明治療后原發(fā)腫瘤灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，直至消失。上述研究表明可以使用PSMA-[18F]DCFPyL的PET顯像對(duì)CAR-T體內(nèi)分布、增殖等生物學(xué)行為進(jìn)行長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

除臨床前研究外，核醫(yī)學(xué)成像用于細(xì)胞治療的臨床研究也廣泛開展，如其在卵巢癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等癌癥的研究。為評(píng)估基因修飾的自體干細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌的安全性，Kershaw等[42]進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)，這是第一篇用基因重組T細(xì)胞治療人卵巢癌的文章，研究中用111In-oxine標(biāo)記治療性T細(xì)胞，采用核醫(yī)學(xué)成像對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤，結(jié)果顯示T細(xì)胞最初在肺部集聚，隨后轉(zhuǎn)移至肝和脾，然而在腫瘤部位未見濃聚，這也與患者臨床反應(yīng)較差一致。盡管基因重組T細(xì)胞未獲得較好的臨床療效，但該研究提示活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤技術(shù)對(duì)臨床方案的指導(dǎo)具有重要意義。

綜上所述，核醫(yī)學(xué)成像具有較理想的靈敏度、分辨率和穿透性，是活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤的理想方式，但需要放射性核素，儀器成本較高，同時(shí)對(duì)于特定監(jiān)測(cè)對(duì)象需要開發(fā)特異性的分子探針。

4 多模態(tài)成像

常用活體顯像技術(shù)特點(diǎn)對(duì)比見表1。

表1 常用活體顯像技術(shù)對(duì)比表

分子影像技術(shù)在活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤方面各有優(yōu)缺點(diǎn)，利用單一成像技術(shù)對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤存在如下挑戰(zhàn)：標(biāo)記效率較低；細(xì)胞增殖導(dǎo)致顯像探針稀釋或丟失；細(xì)胞死亡導(dǎo)致特異性差；吞噬作用造成信號(hào)監(jiān)測(cè)誤差；標(biāo)記物脫靶的潛在副作用等。因此，開發(fā)新的多功能探針，使用多模態(tài)成像技術(shù)，可以提供更多信息。Lim等[1]開發(fā)了一種雙環(huán)[6.1.0]壬炔-共軛乙二醇?xì)ぞ厶羌{米粒(BCN-NP)作為雙模干細(xì)胞成像探針的遞送系統(tǒng)，對(duì)人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行生物正交標(biāo)記，在光照血栓中風(fēng)模型小鼠上應(yīng)用NIRF/T2加權(quán)磁共振雙模成像技術(shù)對(duì)標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了14 d的有效追蹤。此外，Tang等[43]用125I標(biāo)記熒光二氧化硅涂層SPIO，合成了一種具有MRI/SPECT/熒光3種顯像功能的分子探針，成功定量地追蹤到了靜脈注射的間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血性腦卒中大鼠模型體內(nèi)的遷移和生物分布。

5 展望

建立高靈敏度、高特異性的定量分析方法是對(duì)活體細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)行為示蹤的關(guān)鍵。將多個(gè)檢測(cè)探針結(jié)合到一個(gè)分子中可以提供互補(bǔ)的成像信息，多模態(tài)成像特異性分子探針因可綜合多種顯像方式的優(yōu)點(diǎn)，受到研究者的關(guān)注。靶向多模態(tài)成像和理論方法正逐漸成為研究熱點(diǎn)，其能為活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤提供活體、無(wú)創(chuàng)、定量、精確、特異性、縱向的監(jiān)測(cè)手段。目前有關(guān)多模態(tài)成像用于活體細(xì)胞體內(nèi)示蹤的研究越來(lái)越多，多模態(tài)成像及特異性分子探針的研發(fā)將是未來(lái)的研究方向。